高渗盐水联合丹参预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用研究

窦俊峰　王家祥

（1.郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450052；2.河南省卫生学校附属医院，河南 安阳 455000）お

摘 要：目的：研究高渗盐水联合丹参预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及作用机制。方法：将75只健康雄性SD大鼠（体重230g左右），随机分为5组，每组15只：假手术组（Ⅰ组）、缺血再灌注组（Ⅱ组）、高渗盐水预处理组（Ⅲ组）、丹参预处理组（Ⅳ组）和高渗盐水联合丹参预处理组（Ⅴ组）。分别建立大鼠肝脏缺血再灌注模型，观察肝脏缺血30min再灌注6h后血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）和肿瘤坏死因子-α （TNF-α）水平并观察肝组织病理学改变。 结果：Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组血清中ALT、AST、LDH和TNF-α含量明显高于Ⅰ组（P<0.05）；Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组明显低于Ⅱ组（P<0.05）；Ⅲ组和Ⅳ组明显高于Ⅴ组（P<0.05）；Ⅲ组和Ⅳ组之间差别无统计学意义（P>0.05）。肝组织病理学损害：Ⅰ组最轻，Ⅱ组最重，Ⅲ、Ⅳ组次之，Ⅴ组轻于Ⅲ、Ⅳ组。 结论： 高渗盐水、丹参预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤均具有保护作用，2种药联合应用效果更好。

关键词：大鼠；肝脏；缺血再灌注损伤；高渗盐水；丹参；药物预处理

中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-2197（2009）03-0013-02

肝脏缺血再灌注损伤是肝脏外科疾病中常见的病理过程，它可使肝代谢解毒能力降低、微循环阻力升高，严重者可导致肝功能衰竭，直接影响到疾病的预后、手术成功率和病人存活率。因此，对肝脏缺血再灌注损伤作用机制及防治的研究，具有很重要的临床意义。最近研究表明高渗盐水和丹参对大鼠肝脏缺血再灌注损伤有一定的保护作用^[1-3]；但是两药联合应用是否具有更好的效果尚无定论。本实验研究观察了两药联合应用对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用，并初步探讨了其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SD大鼠75只，体重230g左右，河南省实验动物中心提供。

1.2 实验用药品及试剂

血清TNF-α试剂盒购于中国人民解放军总医院科技开发中心放免研究所。

1.3 实验分组

健康雄性SD大鼠75只随机分为5组，每组15只：假手术组（Ⅰ组）、缺血再灌注组（Ⅱ组）、高渗盐水预处理组（Ⅲ组）、丹参预处理组（Ⅳ组）和高渗盐水联合丹参预处理组（Ⅴ组）。术前禁食12h，自由饮水。

1.4 实验方法

麻醉采用10%水合氯醛腹腔注射（300mg/kg体重）。Ⅰ组：单纯麻醉和开腹，分离出肝十二指肠韧带，不阻断肝门；Ⅱ组：麻醉后开腹，开腹前10min自阴茎背静脉缓慢注射生理盐水（10mL/kg体重）。用无损伤动脉夹夹闭肝蒂，30 min后移走动脉夹恢复灌流，松开无损伤动脉夹恢复血流开始再灌注计时，关腹。再灌注6h后开腹，自腹主动脉取血4mL、2mL送本院生化检验中心检测ALT、AST和LDH，其余血室温静置30min后，3000r/min离心30min，提取血清标本-20℃保存待测TNF-α。取1.0cm×1.0cm×0.5cm大小左肝组织，置于10％ 中性甲醛溶液中，备做光镜检查。Ⅲ组：开腹前10min自阴茎背静脉缓慢注射高渗盐水（浓度7.5%，10mL/kg体重），其余步骤同Ⅱ组。Ⅳ组：开腹前10min自阴茎背静脉缓慢注射丹参注射液（10mL／kg体重），其余步骤同Ⅱ组。Ⅴ组：开腹前10min自阴茎背静脉缓慢注射丹参注射液5mL／kg体重和高渗盐水（浓度7.5%，5mL/kg体重），其余步骤同Ⅱ组。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 血清生化酶检测

全自动生化分析仪检测血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和乳酸脱氢酶（LDH）。1.5.2 血清TNF-α检测

按照试剂盒说明书检测血清TNF-α。

1.5.3 肝组织病理学检查

10％中性甲醛溶液固定的肝组织块石蜡包埋后，切片，苏木素-伊红（HE）染色，光镜下观察组织学变化。

1.6 统计学分析

采用SPSS11.5统计软件进行统计分析，所有数据均以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析（F检验），组间比较用q检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 血清生化酶的改变

肝脏缺血30min再灌注6h后Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组血清ALT、AST、LDH水平明显高于Ⅰ组（P<0.05）；Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组明显低于Ⅱ组（P<0.05）；Ⅲ组和Ⅳ组明显高于Ⅴ组（P<0.05）；Ⅲ组和Ⅳ组之间差别无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.2 血清肿瘤坏死因子-α

肝脏缺血30min再灌注6h后Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组血清肿瘤坏死因子-α水平明显高于Ⅰ组（P<0.05）；Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组明显低于Ⅱ组（P<0.05）；Ⅲ组和Ⅳ组明显高于Ⅴ组（P<0.05）；Ⅲ组和Ⅳ组之间差别无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.3 病理组织学观察

光镜下观察，Ⅰ组肝小叶结构及肝窦内皮细胞均正常，肝窦畅通；Ⅱ组肝小叶结构紊乱，肝窦严重狭窄，肝细胞水肿变性，可见部分肝细胞坏死；Ⅲ组可见部分肝细胞变性，肝血窦内轻度瘀血，未观察到明显的坏死细胞；Ⅳ组肝小叶结构尚可，可见部分肝细胞变性，肝窦仍然保持畅通，未观察到明显的坏死细胞；Ⅴ组肝小叶结构基本正常，肝窦畅通，无明显的肝细胞坏死。

3 讨论

在复杂肝切除术和肝移植等手术时肝脏缺血再灌注损伤常常难以避免，减轻肝脏缺血再灌注损伤，可从多方面、多角度着手，目前预防肝脏缺血再灌注损伤的措施有药物预处理、缺血预处理、热休克预处理、臭氧氧化预处理、缺氧预处理、局部热应激预处理、缺血后处理等。在众多的处理措施中又以药物预处理的应用前景最为广阔。

药物预处理是指利用某些活性物质直接或间接的药理作用来达到增强组织或细胞对缺血再灌注损伤的耐受性作用，从而减轻肝脏缺血再灌注损伤。

高渗盐水用于治疗肝脏缺血再灌注损伤的实验研究报道不是很多，结果显示在治疗肝脏缺血再灌注损伤的治疗中，高渗盐水有其特有的作用机制，它能提高机体血容量，改善微循环^[4]，增加心脏功能，改善血液动力学，并能减轻血管内皮细胞肿胀及肺泡内皮细胞肿胀，减少组织器官淤血和水肿，从而减轻全身性炎症反应。FAHMEN等^[5]研究也表明高渗盐水能减少中性粒细胞介导的炎性反应所致的组织损伤。最近有学者研究发现，高渗盐水预处理明显增强缺血再灌注后肝脏血红素加氧酶-1（HO-1）mRNA及蛋白表达，明显改善肝脏微循环，对肝脏缺血再灌注损伤具有保护作用。但是高渗盐水的作用机理目前还不十分清楚，尚需进一步研究。

丹参是近年来引起人们重视的一种传统中药，国内在丹参对动物肝脏缺血再灌注损伤的研究上已经取得一定成果，证明其在酶学指标和组织切片上都有一定的效果。丹参注射液是丹参中提取的混合液，主要成分为丹参素、丹参酮、隐丹参酮和原儿茶醛等，临床上可辅助治疗多种病因引起的肝脏损伤^[6]。丹参对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用，其作用机制与抗氧自由基、抑制细胞凋亡及改善低温保存肝脏的能量代谢作用有关^[7]。同时丹参还能保护缺血或残肝细胞以促进肝细胞再生，并可在低温情况下提高组织中ATP含量和Na+-K+-ATP酶活性继而减轻器官在低温下的损伤^[8]。本实验通过联合应用高渗盐水和丹参探讨它们对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用，结果显示单独应用高渗盐水或丹参均能明显降低血清中AST、ALT、LDH及TNF-α的水平，联合应用效果更好，已经过病理观察证实。

综上所述，我们认为高渗盐水和丹参可以降低肝脏缺血再灌注时TNF-α的水平，减轻TNF-α介导的一系列肝脏损伤，从而对肝脏缺血再灌注损伤起保护作用，两药联合应用具有协同作用。

参考文献：

［1］ Ke QH， Zheng SS， Liang TB， et al. Effects of hypertonic saline on expression of heme oxygenase enzyme-1 in hepatic ischemia/reperfusion injury rats ［J］.Chinese critical care Medicine，2006，18（1）：5-8.

［2］ 王建社．肝缺血再灌流损伤和复方丹参保护作用的实验研究［J］．中国组织化学与细胞化学杂志，l997，6（4）：404.

［3］ 苗雄鹰，齐海智．丹参对肝脏再灌注损伤的防护作用［J］．中华器官移植杂志，2000，21（5）：318.

［4］ Gonzalez EA， Kozar RA， Suliburk JW， et al. Conventional dose hypertonic saline provides optimal gut protection and limits remote organ injury after gut ischemia reperfusion ［J］. J Trauma， 2006， 61（1）：66-73.

［5］ Fahrner SL， Shackford SR， Bourguignon P， et al. Effect of medium tonicity and dextran on neutrophil function in vitro ［J］. Trauma， 2002， 52（2）：285-292.

［6］ 吕克之，杨卫平，张明钧，等．丹参注射液在大鼠肝脏热缺血再灌注损伤中的保护作用［J］．外科理论与实践，2007，12（3）：264-267.

［7］ 梁德森，周德良，田茂霖，等．离体肝脏保存再灌注损伤的发生机制及丹参的保护作用的实验研究［J］．哈尔滨医科大学学报，2006，40（3）：196-200.

［8］ 张志伟，吴在德，官阳．丹参对鼠缺血后残肝细胞超微结构的影响［J］．中华实验外科杂志，1995（6）：366-367.

（责任编辑：陈涌涛）