分子标记技术在甜瓜育种中的应用研究进展

刘　英　陈柏杰　金荣荣　汪　磊　曹　虹　尹春花　于守江

摘要：综述了DNA分子标记的优势、种类及DNA分子标记技术在甜瓜育种中的应用研究进展，对DNA分子标记在当前甜瓜育种应用中存在的问题进行了分析，并对甜瓜分子标记的应用前景进行了展望。

关键词：DNA；分子标记；甜瓜；育种

近年来，生物技术的发展为植物遗传育种提供了基于DNA多态性的分子标记，分子标记技术作为常规育种有力的辅助工具，其重要性早已为国际瓜菜育种界所公认。广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳。分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。

1分子标记的种类

分子标记是遗传标记的一种，与形态标记、细胞标记、生化标记3种标记相比，分子标记具有显著的优越性：(1)大多数分子标记是共显性的，对隐性农艺性状的选择十分便利；(2)基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；(3)在发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析。使得对植株基因型的早期选择成为可能。

依据对DNA多态性的检测手段，目前DNA分子标记可分为4大类：第1类：为基于DNA-DNA杂交的DNA标记。该标记技术是利用限制性内切酶酶解及凝胶电泳分离不同生物体的DNA分子，然后用经标记的特异DNA探针与之进行杂交，通过发射自显影或非同位素显色技术来揭示DNA的多态性。其中最具代表性的是发现最早和应用广泛的RFLP标记。第2类：为基于PCR的DNA标记。根据所用引物的特点。这类DNA标记可分为随机引物PCR标记和特异引物PCR标记。随机引物PCR标记包括RAPD标记、ISSR标记等，其中RAPD标记使用较为广泛。特异引物PCR标记包括SSR标记、STS标记等。其中SSR标记已广泛应用于遗传图谱构建、基因定位等领域。第3类：为基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记。这类DNA标记可分为2种类型。1种是通过对限制性酶切片段的选择性扩增来显示限制性片段长度的多态性，如AFLP标记。另1种是通过对PCR扩增片段的限制性酶切来解释被扩增区域的多态性，如CAPS标记。第4类：为基于单核苷酸多态性的DNA标记，如SNP标记。该标记是由DNA序列中因单个碱基的变异而引起的遗传多态性。目前SNP标记一般通过DNA芯片技术进行分析。以上四大类DNA标记，都是基于基因组DNA水平上的多态性和相应的检测技术发展而来的，这些标记技术各具特点并在甜瓜育种中有着各自的优势。

2分子标记技术在甜瓜育种中的主要应用进展

甜瓜是一种世界性的园艺作物，果实香甜可口，是我国广大城乡人民普遍喜食的传统鲜食水果。我国甜瓜栽培已有3 000多年的历史。是世界上最早栽培甜瓜的国家之一，也是世界上甜瓜栽培面积最大、产量最高的国家之一。随着经济的发展和人民生活水平的提高，国内对甜瓜的需求量日益增长。

分子标记作为一种基本的遗传分析手段已开始渗透到蔬菜遗传育种研究的各个方面。甜瓜作为蔬菜作物的一种也不例外。分子标记技术的出现，使甜瓜育种中的“间接选择”成为可能，大大提高了遗传分析的准确性和选择育种的有效性。因而分子标记在甜瓜育种中愈来愈受到重视。甜瓜分子标记与常规育种技术相结合，即分子标记辅助育种(mark-er-assisted selection，MAS)将成为今后甜瓜遗传育种者的主要技术手段。当前的分子标记技术主要广泛应用在甜瓜研究以下领域：

2.1瓜类亲缘关系分析及种质资源鉴定

分子标记所检测的是植物基因组DNA水平的差异，其可用引物多，借助分子遗传图谱对品种之间的比较可覆盖整个基因组，分子标记技术可为甜瓜物种、变种、品种和亲缘类群间的系统发育关系提供大量的DNA分子水平的证据。分子标记为品种资源的鉴定与保存、探究作物的起源与发展进化等提供了可靠的理论依据。

刘万勃等利用RAPD和ISSR分子标记技术对37份甜瓜种质进行了遗传多样性研究，将供试材料分为两大类群：野生甜瓜和栽培甜瓜，其中栽培甜瓜又分为厚皮甜瓜和薄皮甜瓜两大亚群。Baudra-co-Arnas等目利用RFLP技术用32个探针准确鉴别了甜瓜栽培种与野生种。Staub等运用多种分子标记手段对多个国家的甜瓜等瓜类种质资源的种质鉴定、亲缘关系分析和遗传多样性分析等进行了大量的研究，对甜瓜等作物的遗传图谱构建过程中作图亲本的选择以及农业生产中常规育种和分子标记辅助选择做出了巨大贡献。张东晓用14种12个碱基的随机引物对厚皮甜瓜4个品种及13个品系进行随机扩增多态性RAPD分析。结果表明，可用其中6种引物将4个品种及13个品系加以鉴别。不同引物所扩增的特有或缺少的特异性条带可作为鉴定这些品种或品系的分子标记。在RAPD分析基础上计算的4个品种及13个品系之间的遗传相似性系数，与其已知来源及彼此间已知的亲缘关系均很符合。陈劲枫等采用SSR和RAPD 2种分子标记对黄瓜属22份不同类型材料的亲缘关系进行了研究。结果表明，野黄瓜(Cucumis hystrix)与黄瓜(Cucumis sativus L.var.sativus，2n=14)间的遗传距离(SSR:0.59；RAPD:0.57)小于其与甜瓜(Cucumis melo L.var.melo，2n=24)间的距离(SSR:0.87；RAPD:0.70)。Katzir等通过7对SSR特异引物对8份甜瓜种质、11个黄瓜种质、5个南瓜种质、3个西瓜种质进行了遗传多样性分析，结果表明甜瓜比黄瓜、南瓜、西瓜等的遗传多样性要高。

2.2甜瓜遗传图谱构建

遗传图谱的构建是基因组研究中的重要环节，是目的基因分离及序列分析、基因结构和功能鉴定、目标性状分子标记的建立及比较基因组学研究的基础。构建甜瓜遗传图谱，为甜瓜种质资源进行抗病基因和重要农艺性状基因的定位，鉴定与之紧密连锁的分子标记带来了极大的方便。由于形态标记和生化标记数目少，特殊遗传材料培养困难及细胞学研究工作量大等原因，应用这些标记所得到的园艺植物较为完整的遗传图谱很少，而分子标记可以提供大量的遗传标记，而且可显著提高构建遗传图谱的效率。从而为甜瓜品种资源的研究、基因定位、育种中亲本材料的选择选配、育种方案的制定奠定了基础。当前利用分子标记构建甜瓜遗传图谱已取得了如下进展。

Wang等构建第1张甜瓜回交后代的分子骨架图谱，含有197个AFLP位点、6个RAPD位点与1个微卫星位点，覆盖1 942cM遗传距离。Baudracco等在218株F2代群体上用34个RFLP标记、64个

RAPD标记、1个同功酶标记、4个抗病基因位点标记和1个形态学标记构建了甜瓜的第1张分子遗传图谱，包含了14个连锁群，共1390cM的基因长度，标记间的平均距离为12.6cM。

2001年Oliver等构建了甜瓜的连锁图谱，其具有9个连锁群，遗传距离跨度为1 197cM，411个标记(234个RFLP，94个AFLP，47个RAPD，29个SSR，5个内部SSR，2个同功酶)和1个形态学性状。其中66％的标记是共显性标记，这些标记可以作为融合甜瓜和黄瓜图谱的参考。王建设等选用2个中国甜瓜地方品种的自交系4G21×3A832为作图亲本。利用SRAP标记构建了遗传图谱。该图谱覆盖基因组总长2 077.1cM，共12个连锁群，平均密度为11.1cM／位点。邹明学、许勇等指出植物遗传连锁图谱的发展趋势是高饱和化、实用化和通用化。但是，目前的分子标记技术构建的甜瓜遗传图谱密度还不够高。实验表明。RAPD、AFLP、SSR标记数量有限，难以使遗传图谱达到饱和，在甜瓜分子遗传图谱构建中标记偏分离比率变异为5.8％～19.8％。

2002年，Perin等完成了甜瓜的2张永久性群体遗传图谱的构建，并通过116个共同标记进行了图谱整合，利用Védrantais×PI 161375和Védrantais×PI 414723分别构成2个重组自交系为作图群体，整合后的图谱覆盖基因组长度为1 654cM，分成12个连锁群，包含有668个AFLP标记，25个RFLP标记，128个ISSR标记。16个RAPD标记，9个已知功能基因探针和23个形态学标记。整合后的图谱包括大量的IMA标记，因此这张以永久性群体为作图群体的甜瓜图谱可与以前发表的甜瓜图谱进行整合，然后来增加图谱的饱和度和通用度。

2007年，Zalaoa等用USDA846-1和TooMark杂交获得的有81个植株组成的重组自交系群体构建的遗传连锁图谱是最新的1张甜瓜遗传连锁图谱。该图谱由190个标记组成，包括114个RAPD、43个SSR、32个AFLP和1个表型位点，分成15个连锁群，覆盖基因组长度为1116cM，标记平均距离为5.9cM，并对37个OTL进行了定位和分析。Ed-uardo等㈣还利用PI 161375(Songwhancharml SC)×PieldeSapo(PS)构建了由57个单株组成的近等基因系(nearisogenic lines NILs)的DHLs作图群体，并进行了遗传图谱的研究和基因渗入方面的研究。Morales等进行了SNP分子标记在甜瓜图谱构建方面的研究，在15kb的甜瓜DNA序列中成功找到并定位到3个SNP分子标记，该项研究表明SNP在甜瓜中有很高的多态性，为SNP标记在甜瓜及葫芦科遗传图谱的构建进行了重要尝试。随后他们还进行了物理图谱以及基因图位克隆(map-based-cloning)方面的研究。

2.3甜瓜农艺性状定位

Park等。使用ms-3xMission和ms-3xTAM Dulee2个F₂代群体。获得了与甜瓜雄性不育的ms-3基因连锁的RAPD标记OAM08.650。在ms-3xTAMDulce群体中，该标记与榭-3基因连锁距离为2.1cM，在ms-3xMission群体中与ms-3的连锁距离为5.2cM。Silberstein等利用F₂代群体绘制了1张包含179个标记的甜瓜分子遗传图谱，并将抗蚜虫基因(Vat)、雄全同株性型基因(a)和控制种子颜色的基因(Wt-2)、心皮数性状等基因定位在图谱上。雌雄同株的表现型由显性等位基因雄全同株型基因(a)控制，隐性纯合体表现为雄全同株。谢震筛选与雌雄同株型(A)连锁的分子标记，探索了利用分子标记进行甜瓜雌雄同株型自交系辅助选择的可行性，为利用分子标记技术辅助甜瓜育种、加快育种进程，开辟了新的技术途径。

2.4分子标记辅助选择

DNA分子标记辅助选择，是通过利用与目标性状紧密连锁的DNA分子标记对目标性状进行“间接选择”的现代育种技术。该技术可以对作物的“早代”进行准确、稳定的选择，而且可克服再度利用隐性基因时识别难的问题，从而提高育种效率，加速育种进程。由于分子标记的基因型是可以识别的，分子标记对基因型的直接选择就提供了可能。利用分子标记辅助选择，首先要将目的基因进行精确定位。在不同的群体中，标记之间的遗传距离会有所变化，所以要在所研究的材料中根据已发表的资料重新对基因定位。如果目标基因与某个分子标记紧密连锁，那么通过对分子标记基因型的检测，就能获知目标基因的基因型。目的基因和标记的遗传距离应不大于10cM，然后以标记的基因辅助选择。分子标记辅助选择是分子标记在甜瓜育种应用中的最主要方面。

“1998年Weehter等将曾经获得的与抗枯萎病的显性基因Fore-2连锁的长度为1.6kb分子标记进行了片段测序(测序的实际长度为1.5Kb)，将其转化为特异性扩增的SCAR标记，建立了甜瓜抗枯萎病分子辅助育种系统。”王等以W11983G×Strait8的55个F₂代个体和Iudm1×Strait 8的90个F₂代个体为研究群体，从960对RAPD引物产生的135个多态性标记中筛选出5个与黄瓜霜霉病基因(dm)紧密连锁的标记：G14-800、X15-1100、AS5-800、BC519-1100和BC526-1000。

2000年Joobeur等陶利用AFLP和RAPD技术，将抗甜瓜尖镰孢枯萎甜瓜专化型病菌0和l型生理小种的Fore-2(Fusarium oxysporm f.sp.melonis)定位于其构图亲本MR-1中。Wechter等在甜瓜抗病材料MR-1上获得了与抗枯萎病生理小种1连锁的RAPD标记，并成功地将其转化为SCAR标记。Morales等将抗甜瓜坏死斑点病毒NSV标记定位在Oliver构建的甜瓜遗传图谱的第11连锁群上，找到与nsv基因紧密连锁的侧翼标记CTA/ACG-115和OPD08-0.80。遗传距离是5.9cM。赵长增恻运用ISSR标记技术，采用分离群体分组分析法(BSA)。对甜瓜抗白粉病基因相连锁的分子标记进行研究，获得了1个与甜瓜抗白粉病基因连锁的ISSR标记，遗传距离为16.23cM。王建设等在研究甜瓜抗白粉病基因的分子标记辅助选择方法时找到1个与抗病基因位点连锁的分子标记RAPD-S329，其遗传距离为6.81+1.67cM。程振家利用AFLP技术和BSA方法相结合，找到了1个与白粉病抗病基因相连锁的AFLP标记M60E25-520。利用相关分析和回归分析方法分析了F2代群体分子标记和表型性状的

相关性，结果表明，M60E25-520标记与白粉病病情指数达到了极显著相关水平，回归关系也达到了极显著水平，2种分析结果一致，表明M60E25-520标记与控制甜瓜白粉病抗病基因是紧密连锁的。

2.5甜瓜作物品种纯度及杂种后代的鉴定

作物品种改良是通过携带理想性状的育种材料与需改良的品种杂交，再经过选择而获得的。甜瓜杂种优势明显，有效地利用杂种优势是当前甜瓜育种的主要途径。因此，甜瓜作物品种纯度和杂种后代的鉴定具有重要的应用价值，杂种鉴定不仅是保持甜瓜杂种一代品种遗传纯度的需要，也是缩短育种周期的有效措施吲。品种纯度鉴定的常规方法是依据田间表型性状进行鉴定。随着生化标记的发展，品种纯度及杂种后代的鉴定方法又发展为利用同工酶方法进行鉴定，但二者都有其不足。近年来分子标记已用于品种纯度及杂种后代的鉴定，该技术可直接把种子的DNA作为检测对象，在植物体的各个组织、各个发育时期均可检测。可标记数量多，遍及整个基因组：而且不受季节、环境限制，不存在是否表达的问题。RAPD技术已在甜瓜品种纯度及杂种后代的鉴定上得到广泛研究。许亮对甜瓜杂交种纯度进行了RAPD检测。张红等从100条随机引物中筛选出G1：用于甜瓜西域雪2号纯度鉴定。带型偏父。可有效区分母本和杂交种。从19对SSR引物中筛选出9对稳定扩增、多态性丰富的引物构建西域雪1号、西域雪2号的SSR指纹图谱。刘富中等通过PCR程序优化，建立了快速进行甜瓜RAPD分析的技术体系，从80个随机引物中选出5个可进行3个甜瓜杂交种纯度鉴定的引物。发现其中1条引物OPM 17可同时用于3个甜瓜杂交种的纯度鉴定。建立了3个杂交种的特有指纹图谱。

3DNA分子标记存在的问题及其在甜瓜育种中的应用前景

近年来分子标记在甜瓜育种中的应用已经取得了一定的进展，分子标记技术的应用可以提高甜瓜育种效率，加快甜瓜育种进程。然而，到目前为止，利用分子标记大规模培育甜瓜优良品系或品种的愿望仍未实现。究其原因，主要有：(1)甜瓜缺乏高密度的遗传图谱。(2)数量性状标记通用性与准确性有待提高。(3)在分子标记技术方面，我国与国外差距较大，缺乏开发自主标记的能力。甜瓜作物已经获得标记的性状不多。且大多不是基因标记。(4)缺乏分子标记数据处理能力，标记鉴定技术体系的适用化与低成本还需提高。因此，今后甜瓜分子标记工作努力的方向如下：(1)填补连锁图上较大间隙，使其更加“饱和”。(2)寻求一些经济实用的新性状标记，为育种家们提供杂交育种和品种鉴别的实践依据。(3)利用SCAR标记等一些标记手段将不稳定的标记转化为育种上易利用的稳定标记。

近几年来，随着分子生物学的发展，其新成果及其发展的新技术为我们解决分子标记技术中存在的问题提供了可能。随着基因组结构、功能以及生物信息学等研究的深入，随着分子标记技术研究工作的深入发展和实践上的需要，它在甜瓜育种中的应用将会日益实用和完善。