厚皮甜瓜遗传多样性的ＳＳＲ分析

赵　娜　周　晶　杨文才　沈火林　谭　芳　郭　爽　王银磊

摘要：采用61对SSR特异引物对46份厚皮甜瓜材料进行分析，其中52对扩增出条带，47对引物具有多样性，扩增带分子量在150～1500bp，187条谱带中154条谱带具有多态性。多态率占82.35％，平均每个引物可扩增出3.60条带。同时，对材料网纹、果形、单果质量、有无条带、果皮颜色、果肉颜色、肉质、种子、有无麝香味、裂叶、是否自落和花性型等12个性状进行了田间调查，经过phylip软件和NTSYS软件分析后，计算出材料间遗传距离，并做出SSR分子标记和性状2个聚类图。结果显示，46份材料的遗传距离在0.0188～1.2119，而单一性状气味、果皮颜色、果肉颜色和表面网纹的遗传距离都小于0.1，十分接近；2种聚类分析结果存在较大差异。这与供试材料的亲缘关系十分复杂，大部分材料来源相近，具有相同的亲本，和回交亲本存在一定关系。

关键词：甜瓜；遗传多样性；遗传距离；SSR

甜瓜(Cucumis melo L.)属葫芦科(Cueurbitaceae)甜瓜属(Cueumis)异花授粉植物。在世界各地广泛种植，是全球十大水果之一，其种质资源和变异类型极其丰富。1859年法国分类学家Naudin首次将甜瓜分为10个族。我国通常把甜瓜分为厚皮甜瓜与薄皮甜瓜2类，其中厚皮甜瓜是我国保护地和西北地区经常栽培的高效经济作物之一。SSR(simple sequence repeat)即简单序列重复，通常又称为微卫星，其最大特点是检测的位点多态性水平较高。而且重复性较好。2007年，程振家、王怀松等利用AFLP法分析了甜瓜的遗传多样性，将供试材料分成了两大类群，即厚皮甜瓜类群和薄皮甜瓜类群，并进一步将厚皮甜瓜类群分成了4个亚类，与甜瓜传统分类结果基本一致。2006年，盛云燕、栾非时等用SSR分析了甜瓜的遗传多样性，并用NTSYS软件的立体旋转模拟分析和聚类分析2种方法对结果进行分析，结果基本与形态学分类相似。本研究的目的是利用SSR分子标记技术并结合田间性状的观察，研究厚皮甜瓜的遗传多样性，明确供试材料间的遗传距离，了解材料间遗传差异，为甜瓜育种中的亲本选配以及杂交育种提供理论参考。

1材料和方法

1.1试验材料

本试验共收集了46份厚皮甜瓜育种材料(自交系)，见表1，具体性状表现参考表3。试验材料于2007年2月在温室播种，4月2日定植大棚，每个材料定植20株，植株坐果后随机选取10株记载果实性状等表型，并提取DNA。

1.2试验方法

利用61对SSR特异引物对表1中的材料进行研究。引物序列参见Danin-Poleg、Gonzalo、张红和Fazio等的文章，引物由北京三博远志生物有限公司提供，Taq酶和dNTP购自北京天根生物技术公司，PCR-100由Bio-Rad公司生产。

1.2.1DNA提取从每份材料中随机选取植株10株，混合取样，以幼嫩的叶片为材料提取甜瓜基因组DNA。提取方法采用CTAB小量法。提取完毕后利用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度。并将每个样品的浓度稀释到15-25nd/L。

1.2.2SSR分析PCR反应总体积为20μL：其中ddH20为14.4μL，10 xbuffer为2μL，2.5 mmol/LdNTP0.8μL，10pmol/L的上、下游引物各0.2μL，模板DNA为2μL，2.5U/uL Taq酶为0.4μL。在PCR仪上进行PCR扩增。反应步骤为：94℃预变性5min，94℃1min，50℃(45℃，52℃，53℃)45s，72℃1min，36个循环，72℃5min。反应结束后加入3μL变性胶buffer，95℃变性后置于冰盒中待用。

1.2.3银染检测电泳检测采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶系统，缓冲液为IOxTBE，恒功率60W，电泳2h左右，银染检测，扫描并统计结果。

1.2.4田间性状调查对46份材料的田间表现性状进行调查，分别调查网纹、果形、单果质量、有无条带、果皮颜色、果肉颜色、肉质、种子、有无麝香味、裂叶、是否自落和花性型等12个性状。

1.2.5数据处理和分析对扩增图谱进行数据统计，强反应带记“1”，弱反应带重复出现记“1”，弱反应带出现但不重复记“0”，无带记“0”。用PHYLIP3.67数据软件计算遗传距离，用NTSYS软件获得相似系数矩阵：用其中UPGMA方法进行聚类分析，并通过Treeplot生成聚类图。并将田间性状观察数据转化为数字形式，有性状的记为“1”。无性状的记为“0”。利用同样方法进行聚类分析。

2结果与分析

2.1SSR标记多态性分析

61对SSR特异引物对46份厚皮甜瓜材料进行分析(表2)，其中52对扩增出条带，47对引物具有多样性，平均每个引物可扩增出3.6条带。等位位点的范围在1-7个，引物CMAT141、CMCT44、CMGA165和CMTC168的等位位点数最多，其中以引物CMAT141对样品的扩增产物为例，其扩增条带的大小在175-450 bp。共有7个等位位点。在所有引物中扩增出2个等位位点的有13对引物，占所筛选引物的21.31％，片段大小在100～1250bp。扩增出5个位点以上的有16对引物，占所筛选引物的26.22％，片段大小在125～1000 bp；扩增出3～4个等位位点的有17对引物，占所筛引物的27.87％，片段大小在100～1500bp。见表2、图1。

2.2分子聚类与亲缘关系分析

为确定46份甜瓜材料的亲缘关系，分别从基因型和田间性状两个方面进行了聚类分析。46份甜瓜材料的SSR标记的聚类图，以SSR标记扩增结果对46份甜瓜材料进行UPGMA聚类分析。从SSR标记的聚类图(图2)上可以看出，以遗传相似系数0.70为标准可将46份厚皮甜瓜的育种材料划分为6类，第1类包括11份材料(No.21，No.26.No.32，No.36，No.37，No.48，No.72，No.44，No.46，No.74和No.76)，第2类包括16份材料(No.53，No.54，No.41，No.42，No.82，No.58，No.59，No.61，No.60，No.64，No.78，No.79，No.80，No.81，No.69和No.83)，第3类包括3份材料(No.62，No.77和No.71)，第4类包括5份材料(No.27，No.30，No.75，No.73和No.63)，第5类包括7份材料(No.29，No.31，No.38，No.40，No.39，No.55和No.56)，第6类包括4份材料(No.51，No.52，No.84和No.85)；同时，从SSR标记的聚类图上可以看出。这46份厚皮

甜瓜材料的遗传相似系数达到了0.62，说明材料间的亲缘关系还是非常近的。

2.3性状聚类与亲缘关系分析

选择甜瓜材料较稳定的12个表型性状包括网纹、果形、单果质量、有无条带、果皮颜色、果肉颜色、肉质、种子、有无麝香味、裂叶、是否自落和花性型等，转化为数字的形式(表3)，对46份甜瓜材料进行了UPGMA聚类分析。从性状聚类图(图3)可以看出，一些亲缘关系很近的材料被聚到了一起，例如No.29和No.30、No.31，No.39和No.40。No.51与No.52，No.53和No.54、No.55，No.56和No.59，No.73和No.74。其中No.30是No.29转雌性系的BC5F3.No.31是No.29的BC6 No.40是No.39的BC5:No.52是No.51转雌性系的BC4；No.54是No.53的BC4F2，No.55是No.53的BC4；No.59与No.56，No.73与No.74是姐妹系。以遗传相似系数0.70为标准，可以将46份材料划分为4类：第1类包括No.21、No.73、No.74、No.83、No.32、No.42、No.46、No.84、No.51、No.52、No.77、No.53、No.55、No.54、No.61、No.80、No.79、No.44、No.64、No.69、No.7l、No.81、No.29、No.30、No.31、No.78、No.48等27份材料；第2类包括No.26、No.37、No.63、No.27、No.75等5份材料；第3类包括No.62、No.82、No.76、No.56、No.59、No.58和No.72等7份材料：第4类包括No.38、No.39、No.40、No.41和No.60等5份材料。

2.4遗传距离分析

利用phvlip3.67软件对46份材料进行了100次的遗传距离的运算，计算材料间的遗传相似系数(geneticsimilarity，S)，根据遗传相似系数(GS)计算相应的遗传距离(geneticdistance，GD)。从计算结果看出，46份材料的遗传距离值在0.0188～1.2119。其中No.21和No.26的遗传距离最小，No.41和No.84的遗传距离最大。一些亲本和他们的回交后代如No.29和No.30、No.31，No.39和No.40，No.44和No.46、No.48，No.51和No.52以及No.53和No.54、No.55，它们之间的遗传距离都比较小，在0.0828～0.4975，而作为杂交寿研1、2、3、4号新品种亲本的材料如21号与64号、29号与64号、44号与56号.它们之间的遗传距离都在0.4以上。

将46份厚皮甜瓜材料按气味、果皮颜色、果肉颜色和表面网纹等性状分别进行分类，计算单一性状之间的遗传距离。不同果皮颜色之间的遗传距离在0.0564～0.1543，其中白色果皮与淡绿色果皮的遗传距离最大(表4)；不同果肉颜色之间的遗传距离在0.0648～0.0931，其中以白色果肉和橘黄色果肉的遗传距离较大(表5)；表皮不同网纹间的遗传距离在0.0648～0.0931，其中光皮和密网纹的遗传距离较大；在气味方面，有麝香气味和无麝香气味的遗传距离只有0.0391(表6)。可以看出，单一性状间的遗传距离都在0.1000以下，非常小。从SSR标记聚类结果和遗传距离的计算可以看出，46厚皮份甜瓜材料中大部分的遗传距离较近，这是由于所用材料是经由杂交选育而成的育种材料(自交系)，并且包括很多份亲本及其杂交和回交后代。

3讨论与结论

本试验对46份厚皮甜瓜材料进行聚类分析并计算出遗传距离，遗传距离是研究品种间遗传差异的重要参考依据，采用遗传距离较远的优良自交系进行杂交，改良品种得到具有优势的杂交一代是杂交选育亲本的原则之一。从性状聚类的结果可以看出：具有相同亲本和回交亲本的材料遗传差异较小，例如No.29与它的回交6代No.31.No.39与它的回交5代No.40。No.73、No.74与它们的亲本之一No.64.No.75与它的亲本之一No.27的亲缘关系都较近，这与乐锦华等对厚皮甜瓜亲缘关系的研究结果类似。即杂交后代和回交后代易与双亲或是亲本之一聚在一起。

本试验选用2种方法对46份材料进行了聚类分析。从结果可以看出，2种聚类结果存在较大的差异。一些回交后代和杂交后代在性状聚类中能够聚在一起。但在分子聚类中却不一定能聚在一起。例如No.56与它的姐妹系No.58、No.59在分子聚类中没有聚在一起，在性状聚类中却聚在一起。分子聚类的结果更多的从基因位点的角度反应了材料间的亲缘关系，某些位点的差异不一定直接造成性状表现的差异，性状的聚类结果更容易将具有相同表型的材料聚到一起，能明显揭示形态上的差异，本试验只调查了1年的性状数据，因此要想使性状聚类更加准确，可以增加调查的性状种类。采用几年调查的平均值进行聚类。分子聚类与表型性状聚类相比不易受环境的影响，相对于性状聚类更加稳定；本试验的分子聚类中没有针对表型性状选用引物，所用的引物并非直接与这些表型性状有关，或者与表型性状相关的引物所扩增出的位点数占全部引物位点比例太小，以致在分子聚类中无法区分不同的表型性状，从而导致了2种聚类图存在了较大的差异。

在结果的分析中采用phylip3.67软件进行了100次的遗传距离运算从而得出材料间的遗传距离，通过对不同气味、果皮颜色、果肉颜色和网纹遗传距离的计算，可以看出材料的单一性状间遗传距离很近，均＜0.2。本试验引物的覆盖面积较广，结果对于亲本选配具有一定指导作用。由于这46份厚皮甜瓜材料都是育种材料。之间存在复杂的亲缘关系，遗传背景比较狭窄，要想在品种的选育中改变这个缺点，就需要选择遗传距离较大的材料进行杂交，才能获得比较强的杂种优势，同时引入亲缘关系较远的材料来改善育种材料的结构，改变遗传背景狭窄的局限性。