自体骨移植替代方法：一个古老而又年轻的话题

邹学农

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自体骨移植替代方法：一个古老而又年轻的话题

邹学农

长期以来，自体骨移植是脊柱融合、创伤或肿瘤切除后骨缺损修复的金标准，但自体骨移植存在取材有限、失血、延长手术时间、增加病人痛苦等缺点，而且会引起取材部位并发症。为了减少自体骨供区并发症，提高骨缺损修复能力，各种具有骨传导/骨诱导潜能的自体骨替代材料应运而生，主要包括成骨性、骨传导性和骨诱导性三类产品。

由于不同来源异体骨质量不稳定与成骨能力差异，异体骨移植的临床效果一直令人失望。目前临床上几种骨移植替代材料，如珊瑚羟基磷灰石、磷酸钙、硫酸钙、三磷酸钙和胶原-基质羟基磷灰石复合材料，常用于骨缺损的填充与脊柱融合。由于缺乏足够的临床数据支持，医生在选用这些产品时往往难以决策。因此，骨科医师应充分了解这些材料的特性，根据临床需要选择合适的骨移植替代方法。

1965年，Urist等在《科学》杂志上报告了骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）的发现，被认为是最有价值的突破之一。随着分子克隆技术的发展，骨诱导生长因子的研究越来越多。目前在国际上基因重组BMPs已经批量生产。重组人骨形态发生蛋白-2（recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2）和成骨蛋白-1（osteogenic protein-1，OP-1）在临床应用中取得了令人鼓舞的效果。尽管如此，临床上仍然面临许多新的挑战，如剂效关系、载体选择、抗体产生的可能以及高昂的生产成本等，在像我国这样的发展中国家更加难以推广应用。因此，开发高效价廉的新产品与新方法，将具有极大的发展前景。

近30年来，随着材料科学的进展，金属、人工陶瓷、聚合物复合材料均可用于骨组织工程支架和骨科植入体的制作。将支架材料/植入体直接植入病人体内，仅通过周围组织的长入来达到生物学固定，难以实现有目的、可控制的组织再生。而在植入病人体内前，接种足够的种子细胞并复合细胞因子、生长因子、基因等，在生物反应器中诱导细胞扩增与分化，或直接植入病人体内，以机体作为活体生物反应器在体内孵化细胞，可以达到精确控制组织再生的目的。因此，应用组织工程技术不仅可加速组织愈合，还可改善支架材料/植入体的生物相容性，缩短病人的住院时间，延长植入装置的寿命，尤其适用于种子细胞来源有限、骨愈合功能不良的骨缺损患者以及需要进行骨关节功能重建的肿瘤患者，从而为寻找新的骨移植替代方法提供了理论和方法。

长期以来，寻找安全有效的自体骨移植替代方法一直是国际骨科研究的热点之一。本文就自体骨移植替代方法这一古老而又年轻的话题作一简要评述。

1 异体成骨性骨移植替代方法

同种异体骨及脱钙骨基质（demineralized bone matrix，DBM）是最常用的成骨性骨移植材料。虽然异体骨来源丰富，但其却有传染疾病的危险[1]；经过程序化处理的DBM，仍然存在排异反应[2]。动物试验表明，与自体骨移植比较，同种异体骨脊柱融合率低、移植骨吸收快、感染率高[3]。即便如此，同种异体骨移植仍广泛应用于需要植骨融合的脊柱不稳病人。DBM是从同种异体骨中提取的脱钙骨基质，为另一种具有骨诱导性能的骨移植替代产品。DBM来源丰富，动物和临床试验均证实它可诱导骨形成[4]。人类DBM含有多种BMPs，但在创伤修复和骨骼重建的前瞻性随机临床试验中未能取得与自体骨移植相同的效果[5]。

2 骨传导性移植替代方法

目前，美国食品药品管理局（FDA）已批准多种具有骨传导性能的骨移植替代产品包括珊瑚羟基磷灰石、胶原-羟基磷灰石复合材料、磷酸钙、硫酸钙和三磷酸钙（表1）的临床应用。通过新骨长入或长上骨移植替代材料，这些产品通常用于骨缺损的填充与脊柱融合。由于材料的化学组成、结构强度、吸收率与塑形率变化较大，临床上不能确切证实此类产品的有效性。此外，其可操作性不强，易从填充部位分散至周围软组织中，一旦发生感染，难以将骨移植替代材料清除干净。此外，一些宿主的骨床可能不太适合组织生长，从而影响材料与宿主骨整合。

多孔泡沫金属材料是上世纪80年代后期国际上迅速发展起来的一种物理功能与结构一体化的新型工程材料。当制作成人工骨时，除了有利于骨组织的生长外，还能通过孔隙率的多少来调整其弹性模量与人体骨的差异，实现结构和性能上与宿主骨的进一步亲和。多孔泡沫金属钽复合材料（金属小梁骨）具有非降解特性，物理化学性能稳定。这一复合材料是采用化学蒸汽沉积法在均匀的网状碳骨架表面喷涂一层惰性金属钽制作而成，其孔径与孔隙率由泡沫塑料的炭化骨架决定，孔隙间相互连通，弹性模量接近于松质骨。金属小梁骨制作的非骨水泥型人工关节骨接触面在临床上应用已有20余年的历史，通过骨长入金属小梁骨的多孔界面发挥生物学固定作用。近年来，国际上也开发了金属小梁骨椎间融合器，经过作者的系列研究，2007年获得FDA批准应用于临床。在手术期间分离家猪骨髓单个核细胞，将单个核细胞复合透明质酸水凝胶载入空心的金属小梁骨椎间融合器。结果显示，3个月后在融合器中心孔内新骨形成与自体骨或rhBMP-2复合Collagraft材料没有区别，但中心孔内小梁骨更为成熟[6]。而在金属小梁骨融合器的微孔内，自体骨移植3个月后骨长入平均骨量仅11%，6个月后的平均骨量为16%[7]；骨髓单个核细胞复合透明质酸水凝胶载入融合器中心孔内3个月后，新骨长入微孔内的平均骨量达20%[6]。脊柱融合时短期应用双膦酸盐福善美[8]，金属小梁骨作为载体局部释放唑来霉素[9]，可促进新骨长入金属小梁骨的微孔内，从而有利于金属小梁骨与宿主骨的生物学整合。提供初始坚强内固定，可将金属小梁骨椎间融合器自体骨移植后的融合率从64%提高到91%[7]。应用小角度X线散射扫描比较金属小梁骨与钛合金脊柱融合器的骨长入情况，结果证实金属小梁骨的杨氏模量明显低于钛合金，减少了应力遮挡，使新骨更容易直接长入金属小梁骨中[10]。因此，金属小梁骨不仅在临床上可用于骨科创伤与骨肿瘤手术后的大块骨缺损以及脊柱融合，而且可作为骨组织工程支架以及药物缓释载体。

表1 FDA批准的传导性骨移植替代产品的特性

3 骨诱导性移植替代方法

尽管骨诱导性生长因子的实验结果令人鼓舞，但难以在临床广泛应用。直到最近采用重组技术，以rhBMP-2为代表的产品实现了批量生产，这一情况才有所改观。rhBMP-2在动物模型中可诱导新骨形成，动物实验充分证实了rhBMP-2的安全性和有效性[11]。在临床上，rhBMP-2复合不同植入体应用于脊柱融合、骨科创伤与口腔颌面外科。这些产品先后获得FDA认证，包括INFUSETM骨移植替代产品rhBMP-2/ACS+LT-CAGE，2002年7月被批准用于脊椎融合术中治疗某些脊柱退行性病变；INFUSE®Bone Graft 2004年被批准用于髓内钉固定的开放性胫骨骨折，2007年3月被批准用于替代自体骨修复拔牙窝与增高牙槽嵴。由于大量临床前与临床研究的完成以及上述产品的FDA认证，rhBMP-2成为目前发表论文最多、取得重要进展的骨科研究热点之一。

rhBMP-2因其价格昂贵而难以进行广泛的推广应用。最近，动物来源的骨蛋白提取物（animal bone protein extracts）获得成功提取。它不仅原料取自天然，其中的Ⅰ型胶原是细胞之间连接的支架，而且含有多种细胞生长因子[12]，可刺激人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）增殖与成骨分化[13]，因此被认为是一种最有前途且性价比较高的自体骨移植替代材料。从牛骨中提取的骨蛋白提取物在动物实验中取得良好的脊柱融合效果[14]，BMPs提纯物（Ne-Osteo）的前期临床应用亦取得成功[15]。Colloss®主要含有牛Ⅰ型胶原和难溶性骨基质蛋白，可成功修复动物上颌及中耳骨，动物实验和临床试验亦证实其能够促进脊柱融合[16]。但由于疯牛病的原因，牛骨来源的骨蛋白提取物一直未获得FDA认证。

另一种动物来源的骨蛋白提取物是由德国Ossacur AG公司从冰岛马骨中提取的骨蛋白冻干产品（COLLOSS®E）。体外试验显示其含有多种细胞生长因子[12]。动物实验表明COLLOSS®E可异位成骨[17]，其脊柱整合效果与自体骨移植相当。COLLOSS®E经软骨内成骨的机理及骨形成早期的骨结构与rhBMP-2不同[18]。通过复合三维支架材料或生物陶瓷，COLLOSS®E也可用于骨缺损修复或人工关节周围的填充[19]。COLLOSS®E于2007年获得FDA认证和CE商标，目前由德国Biomet公司经销，结合PEEK椎间融合器在欧洲国家应用于临床。高效价廉的特性使其市场前景优于INFUSE®，具有重要的临床应用价值。

4 组织工程骨移植替代方法

在骨科领域里，以多孔生物材料支架结合成骨细胞是最有前途的自体骨移植替代方法。然而，基于支架材料的骨组织工程技术所遇到的一些基本问题尚未完全解决，从而阻碍了该技术在临床上的广泛应用。这些问题包括：（1）常规接种的种子细胞在支架材料中分布不均且接种效率低下；（2）种子细胞的来源有限；（3）种子细胞的免疫异源性反应等。

传统的常规静态接种方法细胞接种效率低下，细胞在支架材料中分布不均。为了提高细胞接种效率，有研究采用动态接种方法如过滤法、振荡灌注法、离心法、连续灌注法[20]等替代静态接种方法。但这些研究分别在单一类型支架材料上进行试验，由于不同支架材料的内部结构与形态各异，直接影响细胞接种效率与功效，所得结果相互矛盾，难以达到理想效果。

骨髓组织除含有造血干细胞外，还含有MSCs。当它以低密度接种时，可形成成纤维细胞样克隆，因此又被称为“成纤维细胞集落形成单位”(colony forming units-fibroblasts,CFU-Fs)。每个克隆各自来源于一个增殖的祖细胞。在适宜的条件下，MSCs具有向中胚层组织细胞分化的能力，根据其所处环境转化为不同类型组织细胞如成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等，并且能在体外自我更新。MSCs在体外表现出高度的增殖能力，1 ml骨髓抽取物最终能产生数亿个MSCs[21]。由于MSCs易于获得，且具有高度的自我更新能力和多向分化潜能，因此被认为是理想的骨组织工程种子细胞。然而，疾病或衰老可使MSCs内在特性与维持“干细胞”特性的壁龛(niche)微环境信号转导发生改变，从而影响MSCs的自我更新和定向分化，使其数量与分化能力迅速降低。在很大程度上，这些改变取决于干细胞自我更新和定向分化每一阶段特定的基因表达方式[22]。例如，沉默干细胞自我更新的基因表达将激活干细胞分化细胞表型特定的基因转录因子。而启动和维持干细胞分化过程中特定的基因表达方式与其独特的表观遗传调控相关。因此，了解干细胞自我更新和定向分化过程中特定基因表达方式的表观遗传调控机制，为种子细胞来源有限、大块骨缺损、骨愈合功能不良患者提供安全有效的组织工程骨移植替代新方法，具有重要的理论意义与临床应用价值。

5 展望

寻找自体骨移植替代方法一直是骨科医生面对的最具吸引力和挑战性的难题，目前所用的替代方法尚无法同时具备良好的骨形成、骨传导和骨诱导性能。综合利用支架材料、细胞因子和干细胞，通过标准化的组织工程技术构建个体化组织工程骨是目前骨缺损修复与脊柱融合研究的热点，也是建立安全有效的自体骨移植替代方法的发展方向。

1 Urist MR.Bone:formation by autoinduction[J].Science,1965, 150(698):893-899.

2 Mizutani A,Fujita T,Watanabe S,et al.Experiments on antigenicity and osteogenicity in allotransplanted cancellous bone [J].Int Orthop,1990,14(3):243-248.

3 Tsuang YH,Yang RS,Chen PQ,et al.Experimental allograft in spinal fusion in dogs[J].Taiwan Yi Xue Hui Za Zhi,1989,88 (10):989-994.

4 Einhorn TA,Lane JM,Burstein AH,et al.The healing of segmental bone defects induced by demineralized bone matrix. A radiographic and biomechanical study[J].J Bone Joint Surg Am,1984,66(2):274-279.

5 Finkemeier CG.Bone-grafting and bone-graft substitutes[J].J Bone Joint Surg Am,2002,84-A(3):454-464.

6 Zou X,Li H,Zou L,et al.Porous tantalum trabecular metal scaffolds in combination with a novel marrow processing tecknique to replace autograft[J].Adv Exp Med Biol,2006, 585:197-208.

7 Zou X,Li H,Teng X,et al.Pedicle screw fixation enhances anterior lumbar interbody fusion with porous tantalum cages: an experimental study in pigs[J].Spine,2005,30(14):E392-399.

8 Zou X,Xue Q,Li H,et al.Effect of alendronate on bone ingrowth into porous tantalum and carbon fiber interbody devices:an experimental study on spinal fusion in pigs[J]. Acta Orthop Scand,2003,74(5):596-603.

9 Tanzer M,Karabasz D,Krygier JJ,et al.The Otto Aufranc Award:bone augmentation around and within porous implants by local bisphosphonate elution[J].Clin Orthop Relat Res, 2005,441:30-39.

10 Bunger MH,Foss M,Erlacher K,et al.Bone nanostructure neartitanium and porous tantalum implants studied by scanning small angle x-ray scattering.Eur Cell Mater,2006,12: 81-91.

11 Yasko AW,Lane JM,Fellinger EJ,et al.The healing of segmental bone defects,induced by recombinant human bone morphogenetic protein(rhBMP-2).A radiographic,histological, and biomechanical study in rats[J].J Bone Joint Surg Am, 1992,74(5):659-670.

12 Nienhuijs ME,Poulsen K,van der Zande M,et al.Analytical assessment of the osteoinductive material COLLOSSE[J].J Biomed Mater Res B Appl Biomater,2009,89B(2):300-305.

13 Woo C,Li H,Baatrup A,et al.Effects of bone protein extract on human mesenchymal stem cells proliferation and differentiation[J].J Biomed Mater Res A,2006,79(3):552-556.

14BodenSD,SchimandleJH,HuttonWC.Lumbarintertransverse-process spinal arthrodesis with use of a bovine bone-derived osteoinductive protein.A preliminary report[J].J Bone Joint Surg Am,1995,77(9):1404-1417.

15 Boden SD,Grob D,Damien C.Ne-osteo bone growth factor for posterolateral lumbar spine fusion: results from a nonhuman primate study and a prospective human clinical pilot study[J].Spine,2004,29(5):504-514.

16 Li H,Zou X,Woo C,et al.Experimental anterior lumbar interbody fusion with an osteoinductive bovine bone collagen extract[J].Spine,2005,30(8):890-896.

17 Li H,Springer M,Zou X,et al.Ectopic bone induction by equine bone protein extract[J].Adv Exp Med Biol,2006,585: 393-402.

18 Foldager C,Bendtsen M,Zou X,et al.ISSLS prize winner: Positron emission tomography and magnetic resonance imaging for monitoring interbody fusion with equine bone protein extract,recombinanthuman bone morphogenetic protein-2,and autograft[J].Spine,2008,33(25):2683-2690.

19 Baas J,Elmengaard B,Bechtold J,et al.Ceramic bone graft substitute with equine bone protein extract is comparable to allograft in terms of implant fixation:a study in dogs[J].Acta Orthop,2008,79(6):841-850.

20 Vunjak-Novakovic G,Obradovic B,Martin I,et al.Dynamic cell seeding of polymer scaffolds for cartilage tissue engineering[J].Biotechnol Prog,1998,14(2):193-202.

21 Bianco P,Riminucci M,Gronthos S,et al.Bone marrow stromal cells:nature,biology,and potential applications[J]. Stem Cells,2001,19(3):180-192.

22 Zou L,Zou X,Chen L,et al.Multilineage differentiation of porcine bone marrow stromal cells associated with specific gene expression pattern[J].J Orthop Res,2008,26(1):56-64.

（本文编辑 白朝晖）

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