甜菜细胞质雄性不育系和保持系花期几种酶活性的比较

吴则东,王华忠,韩英

(1.黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室，哈尔滨150080；2.中国农业科学院甜菜研究所，哈尔滨150501）

甜菜细胞质雄性不育系和保持系花期几种酶活性的比较

吴则东1,2,王华忠1,2,韩英1,2

(1.黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室，哈尔滨150080；2.中国农业科学院甜菜研究所，哈尔滨150501）

利用稳定的甜菜雄性不育系1A、2A为材料，以其相应的保持系1B、2B为对照，在花期取花和叶为试材，对超氧化物歧化酶（杂OD）、过氧化物酶（POD）及过氧化氢酶（CAT）3种酶的活性与甜菜雄性不育的关系进行了分析。结果表明，甜菜不育性的表现仅和花蕾中POD和杂OD的活性降低有关；而CAT活性在花蕾和叶片中不育系和保持系之间均无明显差异。

甜菜；细胞质雄性不育；酶活性

细胞质雄性不育(cytop1asmic ma1e steri1ity，CMS)是广泛存在于高等植物中的一种自然现象。迄今已在200多种高等植物中发现了CMS。它受细胞质基因和细胞核基因的双重控制，是一种不能产生有活力花粉的母性遗传性状［1］。植物雄性不育是作物杂种优势利用的重要途径，并在生产上取得了很大的成功，如我国杂交水稻种植面积占水稻总面积的46%～55%，其产量比常规品种增产20%～30%，同样在甜菜育种上杂种优势利用也很广泛。自20世纪60年代末美国就已经普遍种植雄性不育甜菜单胚杂交种。目前，世界50多个栽培甜菜的国家中除5～6个仍然在使用多胚种外，其余国家甜菜生产中已经全部采用单胚雄性不育杂交种。我国对甜菜雄性不育系的选育和利用起步较晚，20世纪70年代初期才开始进行这方面的研究，对于甜菜细胞质雄性不育产生原因的研究比较少。从发育生物学的观点看，多细胞生物的发育过程可以看作是一系列基因在时间和空间上依次表达的过程，不同器官的分化是在一定条件下基因顺序表达的结果［2］。同工酶是基因表达的次级反应，它们是生物体不同个体、同一个体不同组织器官或生长发育的不同阶段上存在一系列功能相同，但结构上略有差异的酶，利用同工酶分析能较直接地判断基因的存在及其表达规律[3]。

植物雄性不育性与酶活性的关系，已在小麦、辣椒、萝卜、油菜、玉米和高粱等作物中进行了广泛的研究。有人认为在小孢子发育中，酶作用过程的方向和强度的改变引起新陈代谢的紊乱，从而导致淀粉、氨基酸、蛋白质、核酸等物质的含量减少或新陈代谢停止，引起雄性不育[4]。甜菜细胞质雄性不育系和保持系某些酶活性差异的研究在国内已有报道，如孙立险[5]分析了甜菜细胞质雄性不育系和保持系四分体期、单核期、双核期中的POD同工酶，白薇等[6]以甜菜3个细胞质雄性不育系及其相应保持系为材料，对营养生长阶段叶片中的POD、CAT和酸性磷酸酯酶活性进行了研究。但是对甜菜雄性不育系、保持系花期POD、CAT及SOD活性进行比较研究的还未见有报道。本研究以稳定的不育系1A、2A及其同源保持系1B、2B为材料，探索3种酶活性和甜菜雄性不育的关系，为甜菜细胞质雄性不育性的生理机理研究提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料是中国农业科学院甜菜研究所以国外引进的成对甜菜单胚不育材料为不育源，利用国产优良的多胚保持系作轮回父本对其同步回交改良，并自交5代以上而育成的生物学及经济学性状均优并稳定遗传的甜菜单胚雄性不育系和保持系。该试验以2对甜菜单胚细胞质雄性不育系及其相应保持系为材料，不育系代号为1A、2A，相应保持系为1B、2B，母根栽植时间是2005年4月21日，取样时间为6月15日(开花期），各材料分别选取30株生长健壮的个体，每株取5个上位叶片及5个未开放的花蕾作为试验材料，用冰壶带回实验室，蒸馏水冲洗干净后用纸吸干，称取鲜样各1g，放置在超低温冷冻冰箱中保存备用。

1.2 测定方法

1.2.1 酶的提取取样品1份，放入冰浴的研钵中，加少量石英砂，加pH 6.0的磷酸盐缓冲液(内含2%的聚乙烯吡咯烷酮）约5mL，迅速研成匀浆，4℃时5000r/min离心15min，取上清迅速放入50mL容量瓶中，最后用缓冲液定容至刻度，放置在4℃时冰箱中备用。

1.2.2 酶活性的测定活性的测定采用氮蓝四唑(NBT)法[7]，在OD560下以抑制NBT光化还原的50%表示为1个酶活性单位(U)；CAT活性采用紫外吸收法测定[7]，以每分钟OD240变化0.1为1个酶活性单位(U)；POD活性的测定采用愈创木酚法[8]，以每分钟OD470增加0.01作为1个酶活性单位(U)。

2 结果与讨论

2.1 甜菜雄性不育系和保持系SOD活性的比较

花期供试材料叶片及花蕾SOD活性分析结果如图1。从图1可以看出，在开花期叶片中SOD酶的活性均表现为不育系高于保持系，且1A是1B的1.1倍，方差分析表明，达到显著水平(P<0.05），2A是2B的1.03倍，未达到显著水平(P>0.05）；花蕾中SOD的活性表现为保持系均高于不育系，且1B中SOD的活性是1A的1.13倍，2B中SOD的活性是2A的1.06倍，均达到显著水平。

2.2 甜菜雄性不育系和保持系CAT活性的比较

生殖生长期供试材料花蕾及叶片CAT活性分析结果如图2。从图2可以看出，在花期叶片和花蕾中，均表现为1B高于1A，2A高于2B，两对不育系和保持系间CAT活性之间呈现出相反的趋势，说明CAT的活性和甜菜不育的关系不大。

2.3 甜菜雄性不育系和保持系POD活性的比较

生殖生长期供试材料叶片及花蕾POD活性分析结果如图3，从图3可以看出，在叶片中，表现为1A中POD的活性高于1B，2B中POD的活性高于2A，两对不育系和保持系POD活性之间呈现出相反的趋势；在花蕾中则均表现为保持系POD的活性高于不育系，其中1B是1A的2.53倍，2B是2A的1.84倍，均达到极显著水平。

图1 不育系与保持系花期SOD活性比较

图2 不育系与保持系花期CAT活性比较

图3 不育系与保持系花期POD活性比较

3 讨论

3.1 SOD：SOD普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，对于保护植物、清除超氧阴离子自由基具有重要的意义，从试验结果我们可以看出，在花蕾中两对材料间保持系的SOD活性均高于不育系，且差异显著，说明不育系SOD活性的降低可能使植物代谢中产生的超氧自由基等有毒物质分解降低，使这些有害物质穿透生物膜，导致膜脂过氧化的加剧，结果使花粉败育。

3.2 CAT：CAT是植物体内的活性氧清除酶类，能够清除植物体内产生的有害物H2O2，本试验结果表明，CAT在甜菜整个生殖阶段不育系和保持系之间差异性不强，尤其是在花期的叶片和花蕾中，两对材料之间没有一致性的规律，因此认为，CAT的活性和甜菜不育的关系不大。

3.3 POD：POD是一种含铁卟琳的线粒体外末端氧化酶，在植物组织内广泛存在。它一方面与组织的呼吸和物质的氧化等生理生化过程密切相关，同时又是清除活性氧的酶保护系统的重要成员之一，因此，在呼吸代谢和氧自由基清除中有积极功能。POD在植物组织中具有氧化1AA的作用，不育系POD活性的增高必然导致组织1AA含量的降低，这与前人在棉花[9]、榨菜[10]等的研究结果相一致，说明POD活性的增强在花粉的败育中具有重要的作用。本实验的研究结果表明，甜菜在生殖生长阶段叶片中POD活性在不育系和保持系之间未表现出一致性的规律，只有到花期的花蕾中才表现出保持系POD活性均高于不育系，且差异极显著，因此认为不育系中POD活性的降低，导致活性氧增加可能与小孢子的败育有关。

植物的一切生理生化过程都是在酶的作用和参与下完成的，而且酶是基因表达的直接产物，按照一个基因编码一个同工酶亚基的理论，可以由同工酶的差异直接推测基因型的不同，因此探讨酶的作用有着十分重要的意义。本试验中的两对同型不育系和保持系是经过多年系统选育而成的，具有稳定的遗传性，其不育株与可育株的遗传基础基本上是相同的，仅在育性上表现不同。因此，不育株与可育株在活性上的差异，与核内不育基因的表达有关。因此两系间同工酶的差异表达，有可能引起代谢紊乱，导致雄性器官不育发生。因此从3种酶活性与甜菜不育性的关系可以看出，甜菜不育性的表现仅和花蕾中POD和SOD的活性降低有关，而和CAT活性无关，说明甜菜雄性不育的基因可能仅在花蕾中表达，而不在叶片中表达。但是，与小麦、水稻的生理生化机制的研究相比，甜菜雄性不育的生理生化机制研究落后甚远，还需进一步深入研究。

［1］赖锦盛，戴景瑞，谢友菊，等.植物细胞质雄性不育系的分子基础研究[A].作物雄性不及杂种优势研究进展(1)[C].北京.中国农业出版社，1996：82-86.

［2］A1pert P，Lumaret R，Guisto F D.Popu1ation structure inferred from a11ozyme ana1ysis in the c1ona1 herb，Fragaria chiloensis (Rosaceace)[J].Amer.J.Bot.，1993，80(9).1002-1006.

［3］王中仁.植物遗传多样性和系统学研究中的等位酶分析[J].生物多样性，1994，2(1).38-43.

［4］李殿荣.甘蓝型油菜雄性不育系、保持系、恢复系选育成功并大面积推广[J].中国农业科学，1986(4).94.

［5］孙立险.甜菜雄性不育系及保持系的过氧化物酶同工酶初步分析[J].中国甜菜，1986，(4).21-25.

［6］白薇，田自华，盖连玉，等.甜菜胞质雄性不育系与其保持系某些酶活性的差异[J].华北农学报，2004，19(4).70-73.

［7］邹琦.植物生理学实验指导[M].北京：中国农业出版社，2003

［8］王金胜.实用生物化学技术[M].太原.山西高校联合出版社，1994.119-135.

［9］黄晋玲，杨鹏，李炳林.棉花晋A细胞质雄性不育系酶活性的研究[J].棉花学报，2004，16(4).229-232.

［10］胡美华，陈竹君，汪炳良.榨菜胞质雄性不育系及其保持系若干生化特性的比较[J].浙江农业大学学报，1998，24(1).57-58.

Several Anthesis Enzyme Activities of Sugarbeet CMS and Maintainer Lines

WU Ze-dong1，2，WANG Hua-zhong1，2，HAN Ying1，2
(1.The Key Laboratory of Sugarbeet Genetic Breeding,Heilongjiang University,Harbin 150080,China; 2.Sugarbeet Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150501,China)

The activities of the enzyme SOD，POD and CAT in 1eaves and f1ower buds of cytop1asmic ma1e steri1ity(CMS)sugarbeet 1ines 1A and 2A and their maintainers 1B and 2B purified for generations was ana1yzed on f1owers and 1eafs during Anthesis.The resu1ts showed that the expression of CMS sugarbeet re1ated to the decrease of POD and SOD activities，there was a significant difference in activities of SOD and POD between CMS and their maintainer 1ines in f1ower buds，but there was no significant1y different to activity of CAT.It showed that the genes re1ated to cytop1asmic ma1e steri1ity probab1y expressed in the reproductive organ and it had no effect on the nutritive organ.

Sugarbeet;Cytop1asmic ma1e steri1ity;Enzyme activities

杂566.301

A

1007-2624(2009）01-0027-02

2007-05-29

国家“863”项目(2001AA241192）。

吴则东(1972-），男，黑龙江省依兰县人，助理研究员，主要从事甜菜遗传育种的研究。