积雪草甙对兔耳增生性瘢痕ＴＧＦ－β１ｍＲＮＡ表达的影响

赵文鲁　匡瑞霞　刘　肃　陈　璐

[摘要]目的：通过建立兔耳腹侧增生性瘢痕的模型，探讨积雪草甙（Asiaticoside,Ad）对TGF-β1 mRNA表达的影响。方法：新西兰大白兔20只（喂养过程中死亡4只），在兔耳腹侧制备直径为1cm、深达软骨膜的圆形瘢痕93个，随机分为4组：空白对照组、得宝松组、低浓度积雪草甙组（25mg/ml）、高浓度积雪草甙组（50mg/ml），分别于瘢痕制备3天后局部应用相应药物，2周后取材，分别测量瘢痕组织TGF-β1 mRNA的表达量。结果：积雪草甙组与空白对照组相比，TGF-β1mRNA表达量明显降低，有明显统计学差异（P<0.01）；积雪草甙与阳性对照组相比，二者mRNA表达量无统计学差异（P>0.05）；积雪草甙组之间，高浓度组与低浓度组相比有统计学差异（P<0.05）。结论：较高浓度积雪草甙注射液局部注射可以减少增生性瘢痕TGF-β1 mRNA的表达。

[关键词]增生性瘢痕瘢痕；积雪草；TGF-β1；荧光PCR

[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2009）01-0072-04

Effects of asiaticoside on the expression of TGF-β1 mRNA in hypertrophic scar model of therabbit ears

ZHAO Wen-lu,KUANG Rui-xia,LIU Su，CHEN Lu

(Department of Cosmetic Surgery, the Affiliated Hospital of Medical College Qingdao University, Qingdao 266003,Shandong,China）

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of Asiaticoside on TGF-β1 mRNA expression in hypertrophic scars.MethodsNinety-three full-thickness round wounds (1cm in diameter on ventral side of rabbits ears)on rabbits' ears of 20 rabbits（four died） were created. Then rabbits were randomized into 4 groups: negative group, diprospan group, asiaticoside（25mg/ml）group andasiaticoside（50mg/ml）group. The corresponding injectant were given three days after the scar model was formed lasting for 7days.Samples were collected 2 weeks later and expressions of TGF-β1 mRNA of different groups were detected.ResultsAsiaticoside group has a lower expression of TGF-β1 mRNA compared with negative group（P<0.01），while there are no respective diversity（P>0.05） between asiaticoside group and masculine group. As to the two asiaticoside groups, group of higher concentration has a lower expression of TGF-β1 mRNA and the difference is significant.ConclusionHigher concentration of asiaticoside injected could inhibittheexpressionofTGF-β1 mRNA

Key words: hypertrophic scars; TGF-β1;asiaticoside;quantitative RT-PCR

增生性瘢痕的形成是由于皮肤创伤后的愈合过程中成纤维细胞过量增殖和胶原纤维过度增生的结果，增生性瘢痕的防治是现代医学的难题之一，寻找治疗和预防瘢痕增生的药物具有重要的意义。积雪草甙为积雪草提取物三萜皂甙的主要成分之一，已有的资料显示，在各种皮肤损伤修复治疗中，无论是在正常创面，还是在延迟愈合的创面中，积雪草甙（Asiaticoside，Ad）均具有促进皮肤损伤修复的药物活性。临床上，已有积雪草甙的片剂和霜剂的应用，本实验是对兔耳增生性瘢痕的局部注射该提取物，通过RT-PCR方法对比研究其前后TGF-β1 mRNA的表达有无统计学差异，进而为临床上治疗增生性瘢痕寻找新的治疗途径。

1材料和方法

1.1 实验动物及主要试剂、仪器：新西兰大白兔20只，体重2.2～2.7kg，雌雄不拘，购自山东省实验动物中心，由青岛大学医学院附属医院实验动物中心代为饲养。适应性喂养1周，死亡2只，剩余18只。积雪草甙标准品，由西安市小草植物开发有限公司惠赠； SYBRPremixScript 逆转录试剂盒及定量PCR试剂盒（日本TaKaRa公司）；RT-PCR引物： TGF-β1 mRNA 序列取自美国基因库，引物采用Primer5软件设计，所有引物由上海生工生物技术有限公司合成（见表2）；冷冻高速离心机(日本Sigama公司)、7500 型荧光定量 PCR 仪(美国Bio-Rad公司)、普通离心机、研磨机、震荡仪、-70℃冰箱

1.2 兔耳瘢痕模型的制作：氯胺酮和地西泮按分别按2mg/kg和5mg/kg肌肉注射麻醉，然后在兔双侧耳腹侧分别作3～4个直径为1cm的圆形切口，切口间距1cm，完整切除皮肤全层至软骨膜表面，并切除软骨膜，保留耳软骨。创面压迫止血后予以暴露，无需包扎。术后3天死亡2只，剩余16只，共形成高出正常皮肤的瘢痕块93个。

随即选择每只兔的左右侧耳进行药物对比观察，分为空白对照组—低浓度积雪草甙组、空白对照组∣高浓度积雪草甙组、空白对照组∣得宝松组、低浓度积雪草甙组∣高浓度积雪草甙组、低浓度积雪草甙组∣得宝松组、高浓度积雪草甙组∣得宝松组；共得到空白对照组19个瘢痕块、得宝松组22个、低浓度积雪草甙注射组24个（25mg/ml）、高浓度积雪草甙注射组28个（50mg/ml），各组分别于瘢痕制作后3天开始隔天局部注射得宝松和相应浓度积雪草甙药液0.5ml/个，各组局部药物注射均持续至瘢痕制作术后10天。于瘢痕制作术后2周切取瘢痕组织标本。

1.3 HE染色：于瘢痕制作2周后切取瘢痕组织，随即固定于中性甲醛液，常规石蜡包埋，4μm切片，切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗，然后苏木素染色5min、自来水冲洗，盐酸盐酸乙醇化30s，置伊红液2min，再经常规脱水、透明、封片，镜检。

1.4 总RNA的提取：应用TRIzol试剂盒，方法按说明书进行。所提取的总RNA用紫外分光光度计定量，A260/A280值≥1.8的进入下一步实验。

1.5 实时定量荧光PCR扩增：逆转录反应严格按照试剂盒操作说明进行；PCR扩增反应体系（20μl）含SYBRPremix ExTaqTM（10μl），PCRForwardPrimer(0.7μl)，PCRReversePrimer(0.7μl)，ROX Reference Dye II(0.4μl)，dH2O(5.1μl)，cDNA(2μl)。反应条件：90℃10s, 94℃5s,60℃45s,共40个循环。 TGF-β1 mRNA 的定量：采用相对定量法。以GAPDH为参照，利用Ct值计算TGF-β1 mRNA 的相对量。TGF-β1 mRNA/GAPDH用下述公式计算：2-△ct。

1.6 统计学方法：采用SPSS11.5统计软件处理系统，组间差异采用t检验进行比较。P<0.05有统计学意义。

2结果

2.1 大体情况：空白对照组瘢痕块颜色较红，质地较硬，瘢痕高出皮肤平面，增生范围未超出原创缘；得宝松组和积雪草甙组瘢痕颜色淡，质软。如图1。

2.2 病理结果：HE染色观察可见，空白对照组毛细血管增生明显，有大量成纤维细胞，核大、密集，排列不规则；积雪草甙组和得宝松组成纤维细胞数量较少，核较小，排列相对规则。如图2。

2.3 荧光强度曲线：荧光PCR 仪在PCR 扩增过程中,会自动记录每一循环的荧光强度,故称实时荧光PCR ,在最佳实验条件、相同扩增效率的前提下,反应体系产生一定强度的荧光信号所需的扩增循环数与反应体系中的原始模板数成反比。通过对荧光信号及扩增进程的实时监测,以荧光强度与循环数建立坐标,阳性标本呈现典型的S 形曲线,电泳图见特异性条带，而阴性对照呈一条不规则的波浪线。根据各组不同的Ct值算出相应初始cDNA的相对量，应用SPSS11.5统计软件分析。

2.4核酸初始相对量：根据不同组、不同引物得出不同的荧光标准曲线，根据曲线中的Ct值由上述公式算出相应初始cDNA的相对量（TGF-β1 mRNA / GAPDH mRNA），如表1。

2.5 PCR扩增结果，见表2。

3讨论

本实验采用兔耳瘢痕模型，是基于动物自身对创伤的修复反应与人类病理性瘢痕产生的过程颇为相似。优点是运用这一模型可以对瘢痕组织的产生、发展及转归进行动态的连续性的观察,可随时留取瘢痕标本,便于对病理性瘢痕组织进行全面系统的研究。国内李荟元[1]等从1998年开始研究兔耳增生性瘢痕模型的建立，成功从20只新西兰大白兔兔耳腹侧面制造增生明显的瘢痕80余处；李希军[2]、周勤生[3]等也先后成功复制本模型，成功率高、稳定。我们在实验模型中制作109处创面，共形成高出正常皮肤表面得增生性瘢痕93个，成功率为85.32%，具备了统计检验的标本数量。

本实验采用SYBR Green染料法，是荧光实时定量 PCR技术的一种，即是在 PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号实时检测整个 PCR过程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。它是近年来发展起来的一项新的核酸定量技术,其分辨率比传统 PCR高,定量更准确,受循次数的影响小 ,由于其在扩增的同时采集数据 ,可避免普通PCR后处理对结果的影响。其优点是：①无需设计、合成探针,实验成本低；②使用方便,与常规 PCR的操作几乎相同。由于 SYBR Green和双链 DNA是非特异性结合,反应过程中如产生非特异产物、引物二聚体将影响结果的准确性。因此,反应时要设定熔解曲线分析。由图3b可以看到，本实验中，溶解曲线均为单一峰，表明无非特异性扩增。

PCR反应过程中产生的 DNA拷贝数最初呈指数方式增加,随着反应循环数的增加,最终经线性期进入平台期。参数 Ct值代表达到设定可测荧光阈值的循环数，与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。由于Ct值是反映实际 PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数,该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响,因此利用 Ct值可精确判断起始模板拷贝数。

TGF-β[4]有3种亚型，TGF-β1是首先被发现得有利于伤口愈合得因子，陈伟[5]等研究发现，TGF-β1的持续存在会不断刺激成纤维细胞诱导基质产生，导致过度的ECM沉积的纤维反应。Hu[6]等研究表明通过使用透明质酸植入得方法降低TGF-β1含量，能够减少瘢痕形成；Cheng CL[7]等在初步建立兔耳增生性瘢痕模型得基础上，用组织原位杂交方法，对兔耳增生块进行了TGF-β1 mRNA检测，结果各组增生块组织TGF-β1 mRNA表达均较正常皮肤。另外，张选奋[8]等发现，TGF-β1可以活化蛋白激酶C，在瘢痕形成过程中对于其信号转导起一定的作用。这个指标是检测瘢痕形成或者预后的比较好的指标之一，因此我们选用它作为测量指标。

积雪草甙是中草药积雪草的提取物，为三萜皂甙化合物。陈明春[9]等研究表明，中草药积雪草能抑制T细胞和巨噬细胞释放碱性成纤维细胞生长因子，具有抑制成纤维细胞（fibroblast,FB）的增值、促进瘢痕FB凋亡、减少免疫细胞数目、封闭血管、疏松胶原纤维的作用。通过本实验可以发现，高、低浓度（分别为50mg/ml和25mg/ml）积雪草甙组TGF-β1 mRNA相对量与生理盐水组相比较，差异均有明显统计学差异（P<0.05），表明积雪草甙注射液对增生性瘢痕局部内TGF-β1 mRNA有明显得抑制作用。不同浓度的积雪草甙组间相比较（t检验），差异有统计学差异（P<0.05），提示高浓度组能更好地抑制TGF-β1 mRNA的表达；在高浓度积雪草甙组和得宝松组之间的比较中可以发现，二者无明显差异（P>0.05），提示高浓度积雪草甙具有临床推广应用的动物实验基础。

本实验局部应用多种药物对兔耳瘢痕进行治疗，得宝松对于兔耳瘢痕具有较明显的疗效，这与以往的报道基本相同。积雪草甙局部注射可以明显抑制TGF-β1 mRNA的表达，并且在一定范围内疗效与药物浓度成正比。与口服积雪草甙片剂相比较，局部注射可以大大减少全身的副作用，而与积雪草甙霜剂相比，局部注射能更大地提高瘢痕局部的药物浓度。与局部注射糖皮质激素可引起色素脱失、骨质疏松、月经紊乱等相比较，中药的副作用更小，尤其对于禁忌使用糖皮质激素的患者。因此，积雪草甙瘢痕内局部注射具备临床推广的价值。但由于中药本身成分复杂，其具体作用机理往往是多靶点、多环节地，亟需更深层次的研究为其临床治疗提供有力的依据。

[参考文献]

[1]李荟元,刘建波,兰海.建立增生性瘢痕动物模型[J].第四军医大学学报，1998，19（6）：655-657.

[2]李希军,柳大烈,王吉慧.兔耳增生性瘢痕模型建立方法的探讨[J].中国美容医学，2006，5(15)：499-500.

[3]周勤生,马少林,董祥林.兔耳增生性瘢痕动物模型的建立与应用[J].新疆医科大报,2005，8（28）：746-748.

[4]Tateshita T, Ono I, Kaneko F , et al. Effect of collagen matrix containing transforming growth factor (TGF)-beta (I) on wound contraction [J].Dermatol Sci 2001，27(2)：104-113.

[5]陈伟,付小兵,葛世丽,等.增生性瘢痕形成和成熟过程中TGF-β1、TGF-β3及其受体的基因表达变化[J].中华整形外科杂志，2004，7（20）：308-309.

[6]Hu M，Sabelman EE，Cao Y，et al．Three-dimensional hyaluronic acid grafts promote healing and reduce scar formation in skin incision wounds[J].J Biomed Mater Res，2003，67B（I）：586.

[7]Cheng CL，Guo JS，Luk J，et a1．The healing effects of Centella extract and asiaticoside on acetic acid induced gastric ulcers in rats［J］．Life Sci,2004，74(18)：2237-2249．

[8]张选奋,郭树忠,张琳西,等. TGF-β1对兔耳创面肉芽组织和瘢痕组织蛋白激酶C活性的影响[J].中国美容医学，2004，4（13）：140-142.

[9]陈明春,黄茂芳.积雪草甙和苦参碱对皮肤瘢痕成纤维细胞生长及胶原合成影响的研究[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2006，5(1)：11-14.

[收稿日期]2008-09-22[修回日期]2008-12-10

编辑/张惠娟