５－氨基乙酰丙酸代谢产物原卟啉ＩＸ在葡萄酒色斑动物模型鸡冠中的积聚

李　伟　周兆平　桥本贤二

[摘要]目的：研究5-氨基乙酰丙酸（5-Aminolevulinic acid, ALA）在不同给药途径下其代谢产物原卟啉IX （protoporphyrin IX,PpIX）在葡萄酒色斑动物模型鸡冠中的聚集、分布的动态变化，探讨其治疗葡萄酒色斑的可行性。方法：以鸡冠为模型，静脉或局部真皮内注射ALA后，应用多通道光量子分析仪监测代谢产物PpIX的动态变化，组织取材切片后用共聚焦显微镜检测PpIX的分布。结果：在鸡冠组织内，ALA给药后3h PpIX出现明显聚集，分别在给药5h（静脉给药组）和4h（局部给药组）后到达高峰，静脉给药组峰值（94±15）units略高于局部给药组（73±12）units。在身体其它部位的皮肤中，PpIX聚集规律相似，但局部给药组的峰值（38±14）units明显低于静脉组（109±14）units。组织切片荧光检测显示PpIX弥漫性分布于真皮层中。结论：ALA的局部真皮内注射比全身给药用药量小，但能达到同样程度PpIX的积聚，有望成为葡萄酒色斑光动力学治疗的新光敏剂。

[关键词]5-氨基乙酰丙酸；葡萄酒色斑；原卟啉IX

[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2009）01-0060-04

Accumulation of protoporphyrin IX in chicken comb after 5-aminolevulinic acid administration LI Wei1,ZHOU Zhao-ping1,HASHIMOTO Kenji2

(1.Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Shanghai 9th People's Hospital,School of Medicine,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200011,China; 2.Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Hamamatsu University School of Medicine, Hamamatsu, Japan)

Abstract： ObjectiveThe purpose of this study is to investigate the accumulation kinetics and the localization of endogenously synthesized protoporphyrin IX (PpIX) after administration of 5-aminolevulinic acid (ALA) in chicken comb.MethodsThe kinetics of PpIX accumulation after ALA administration through intradermal or intravenous injection was monitored for 24 hours, and the localization of PpIX was observed under confocal microscope.ResultsIn the comb, PpIX accumulation achieved the peak level at 5 and 4 hours after intravenous or intradermal injection of ALA, respectively, and almost completely eliminated within 24 hours. Similar amount of PpIX was observed after local and systemic injection. In the body skin, a similar pattern of PpIX accumulation kinetics was observed, but the PpIX level was much lower in the local injection group. Confocal microscope showed that PpIX distributed evenly in dermis without significant difference between two groups.ConclusionsIntradermal injection of 5-ALA is a safer administration route that could achieve equivalent of PpIX accumulation. It might be applicable to the clinical treatment of port-wine stains.

Key words: 5-aminolevulinic acid; port-wine stains; protoporphyrin IX

葡萄酒色斑是一种临床常见的先天性血管疾病，其病理特征是真皮内广泛的毛细血管或微静脉扩张，最新分类归为微静脉畸形[1]。脉冲染料激光治疗是目前标准的治疗方法，但仅有20%左右的病例可完全消退[2]。早在20世纪90年代，顾瑛等最先证实光动力疗法是治疗葡萄酒色斑的另一有效手段[3]，并在后续的研究中得到了肯定[4]。然而，该治疗中常用的光敏剂，如血卟啉衍生物等，代谢慢，体内残留时间长。为避免药物残留导致的皮肤光毒性反应，患者通常须在治疗后避光一个月，这给病人的日常生活和工作带来极大的不便。

5-氨基乙酰丙酸（5-Aminolevulinic acid, ALA）是血红素合成过程中的原料，本身并不是光敏剂，它在细胞内经酶催化后可转变成光敏剂原卟啉IX (protoporphyrin IX, PpIX)，PpIX 经进一步酶催化后转变成血红素。当有大量外源性ALA存在时，可造成PpIX 在细胞内的快速积聚[5]，此时如接受适当波长的激光照射，可引起光化学反应而造成细胞损伤。根据这一原理，ALA已被广泛用于浅表型皮肤癌、口腔癌、呼吸道以及消化道管腔肿瘤的光动力学治疗中。研究发现，ALA介导的光动力疗法治除了对肿瘤细胞的直接杀伤作用外，破坏血管内皮细胞以造成肿瘤局部微血管的阻塞是另外一条重要机制[5]。根据这一原理，我们推测它可能也适用于葡萄酒色斑的治疗。因此，本研究开展了ALA在葡萄酒色斑动物模型鸡冠中的药代动力学变化和代谢产物PpIX分布的研究，探讨ALA介导的光动力学作用在葡萄酒色斑治疗中的可行性。鸡冠因其含有丰富的毛细血管网，在组织学结构上与临床葡萄酒色斑非常相似，因而常被用作研究葡萄酒色斑的动物模型。

1材料和方法

1.1 光敏剂：ALA购自日本Cosmos Bio公司，使用前在磷酸缓冲液中溶解，添加氢氧化钠调节pH至5。为保证药物活性，溶液在每次实验前现配。

1.2 实验动物：取16只成年莱杭母鸡（体重约1.5～2kg/只），肌肉注射氯胺酮（15mg/kg）和塞拉嗪 （0.6mg/kg）麻醉。

1.3 动态荧光检测：16只鸡均分两组，分别经静脉（200mg/kg）或局部真皮内注射（10mg/cm2/ml）ALA，应用多通道光量子分析仪PMA-10（Hamamatsu Photonics K.K., 日本）在24h内定时活体检测组织内代谢产物PpIX的含量。每只动物检测鸡冠的两个不同区域，同时检测远离鸡冠的大腿外侧两个区域，各检测点直径为2.5mm。

1.4 PpIX组织学分布：给药后5h，取0.5cm2鸡冠组织做冰冻切片，在共聚焦显微镜（MRC600, Nippon Bio-RAD Laboratories，日本）下观察PpIX分布，荧光分析软件计算相关区域荧光强度，以给药前鸡冠组织为正常对照。

1.5 统计学处理：组织内各时间点PpIX的积聚量以（x±s）表示，统计学处理采用student t test分析，P<0.05视为有统计学差异。

2结果

2.1 PpIX积聚动态变化：多通道光量子分析仪PMA-10由光源、双孔探头、光纤、色谱仪和计算机系统组成。检测时410nm的激发光经双孔探头的一个孔照射到检测部位，激发后产生的局部组织荧光经双孔探头的另一个孔传入色谱检测仪，经计算机处理分析300～800nm的波谱。图1显示了PMA-10 检测的典型吸光图谱，波长636nm为PpIX的吸收峰，其峰值高低反映了PpIX的聚集程度。可以看到ALA注射前（0h）波长636nm处未见波峰，注射后5h波峰明显，24h后则基本消退。动态观察发现无论是静脉给药还是局部真皮内注射，在鸡冠部位（图2），给药后3hPpIX显著积聚，分别在5h（静脉给药组）和4h（局部给药组）到达高峰，静脉给药组峰值（94±15）units略高于局部给药组（73±12）units，但无显著性差异（P>0.05,n=16）。随后PpIX聚集逐渐降低，24h后消退。在远离鸡冠的大腿外侧皮肤（图3），PpIX动态变化规律与鸡冠部位相似，给药后3hPpIX浓度明显升高，静脉给药组在8h到达高峰，局部给药在4h到达高峰组，但局部给药组的峰值（38±14）units显著低于静脉组（109±14）units（P<0.05, n=16）。

2.2PpIX组织分布：为了了解PpIX在组织中的分布情况，我们在ALA给药后5h切取鸡冠。由于石蜡切片自发荧光强，而且在脱蜡处理中会造成PpIX的丢失与荧光淬灭，我们采用冰冻切片后在共聚焦显微镜下观察PpIX荧光的分布。与未给药组相比，给药组真皮部位都有弥漫性的PpIX荧光分布（图4），静脉给药组与局部给药组分布无明显差异，未见血管样结构周围荧光聚集的现象。而在表皮层，由于表皮自发荧光强，三组未见明显差异。荧光强度软件分析结果可较清楚地看到给药组真皮层内荧光的均匀分布。

3讨论

由外源性ALA引起的细胞内PpIX聚集，与血红素代谢过程中细胞内的两种酶活性有关：一种是催化ALA转变成PpIX的酶，另一种是催化PpIX转变成血红素的酶。当前者活性高、后者活性低时，会造成细胞内PpIX的短暂聚集。利用不同细胞间这两种酶活性的差异，在给予外源性ALA后，可引起PpIX在不同细胞内的差异性聚集，经进一步光激活，可造成选择性的细胞损伤[5]。一些肿瘤细胞以及血管内皮细胞由于酶活性与其他细胞不同而容易形成PpIX的聚集，成为ALA介导的光动力疗法的靶细胞[5]。该疗法对毛细血管的特异性损伤作用在肿瘤治疗中得到了证实，同时研究证明它对正常毛细血管也有作用[6]，因此ALA介导的光动力疗法很有可能成为治疗皮肤毛细血管畸形的手段之一。

研究最初我们分别采用了静脉注射、真皮内注射以及表面涂敷的方法给予ALA，但表面涂敷给药未见PpIX的显著聚集（结果未显示），这与文献报道结果一致，认为ALA无法穿透正常的皮肤角质层[5]。局部真皮内注射与静脉给药在鸡冠部位可以达到相同的PpIX聚集，而局部给药造成皮肤其它部位PpIX的聚集远远低于全身给药组；即使在同一鸡冠的不同部位，局部注射区远远高于邻近的非注射区（结果未显示）。局部注射后引起的非注射区PpIX积聚，很可能是由于注射的ALA通过毛细血管进入血液并分布到体内其他部位造成的，但毕竟进入血液的量较少，因此并不会造成非注射区PpIX的大量积聚。由此可见，局部用药能在注射区达到同样程度的PpIX积聚，并且优于全身给药，因为它不仅可以大大减少用药剂量，还能避免全身皮肤的光敏毒性作用。当然，局部注射的缺陷在于注射不均匀，可能在光照后产生的效果不均匀，因此对于大面积的病变，全身给药可能更合适。从动态监测可以看到24h内PpIX被基本代谢，与其他常用的光敏剂相比，它的半衰期明显缩短。在临床应用中，这将大大缩短治疗后的避光时间。

在皮肤及消化道浅表肿瘤的光动力学治疗中，ALA的全身和局部给药可以导致肿瘤细胞内PpIX积聚，同时也在肿瘤组织内的血管内皮细胞中积聚[4]。本研究中激光共聚焦观察发现PpIX在真皮层中弥漫性分布，并非局限于血管样结构周围，提示PpIX的积聚可能同时存在于真皮中的主要细胞成分成纤维细胞和血管内皮细胞中。以往研究发现体外培养的真皮成纤维细胞在外源性ALA处理后能产生PpIX积聚[7]，并对进一步的光照产生反应。Chang等研究发现体外培养的血管内皮细胞在ALA处理后有PpIX的聚集[8]，并在照射激光后细胞死亡。他们进一步在鸡冠模型中尝试了全身给药后照射激光治疗，发现光照后照射部位的缺血性变化[8]，提示ALA介导的光动力疗法治疗葡萄酒色斑的可行性。然而，Evans等曾经尝试应用在脉冲染料激光治疗临床葡萄酒色斑的同时辅助光动力治疗，结果并未看到附加的效果[9]，他们在讨论中提到一种可能是脉冲染料激光治疗本身已造成足够程度的血管损伤，辅助的光动力学作用不能体现；另一种可能是照射时间（全身给药后1～2h）以及照射剂量不合适，不能达到治疗效果。从本研究可以看到无论何种给药方式，都能在真皮内产生PpIX积聚，其高峰时间在用药后4～5h，如果光照时间与剂量合适的话，理论上能达到治疗效果。

总之，ALA的局部注射给药可引起PpIX在局部的聚集，并能避免静脉给药造成的全身性光敏毒性副作用，其介导的光动力作用有待进一步开展照光研究加以证实，ALA有望成为治疗葡萄酒色斑的新光敏剂。

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[收稿日期]2008-09-25[修回日期]2008-12-10

编辑/张惠娟