一种潜在的组织工程支架材料——细菌纤维素

李 喆 王华平 陈仕艳

一种潜在的组织工程支架材料
——细菌纤维素

李 喆 王华平 陈仕艳

纤维素是丰富的天然聚合物，主要分布于植物以及真菌、藻类中。其中，细菌纤维素（Bacterial cellulose,BC）以其独特的超细纤维网络结构、卓越的机械性能、良好的生物相容性和生物可降解性在生物医用领域引起了人们的广泛关注。

自1987年以来，关于用BC膜治疗烧伤、烫伤、褥疮、皮肤移植、创伤和慢性皮肤溃疡等成功病例已屡见不鲜，并且已经有用于人工皮肤、纱布、绷带等的敷料产品[1]，如由Fontana等[2]研发的BC产品BiofillR，已经被证明在二级和三级烧伤、烫伤、皮肤移植、慢性皮肤溃疡等皮肤损伤方面有非常显著的疗效。另外，Xylos公司推出的由Alvarez等[3]研制的XCellsR纤维素创伤敷料和XCellsR抗菌创伤敷料也已在临床上得到了广泛的应用。同时，BC已经被证明可以应用在人工血管、药物载体以及引导组织再生等方面[4-6]。

随着医学的发展，人们对BC作为一种优秀的生物材料在组织工程方面的应用进行了大量研究，本文将就BC在组织工程方面的研究现状进行综述。

1 细菌纤维素的特性

细菌纤维素由Acetobacter、Agrobacterium、Pseudomonas、R hizobium和Sarcina等菌株生产，其中研究最多、产量最高的是木醋杆菌（Acetobacter xylinum）[1]。从化学组成来看，BC与植物纤维素相似，都是由吡喃型葡萄糖单体（β-D-葡萄糖）通过β-1,4-糖苷键连接而形成的一种无分支、大分子直链聚合物，直链之间彼此平行，不呈螺旋构象，无分支结构[7]。在此合成过程中，培养液的液面形成三维的凝胶状BC。这种独特的超微纤维网络结构，使其具有优越的机械特性。

BC的微纤丝束直径为3～4 nm，而由微纤维束连接成的纤维丝带宽度为70～80 nm，长度为1～9 μm，是目前最细的天然纤维[8]。BC因为不含有植物纤维中的木质素、半纤维、果胶和阿拉伯聚糖等，因此具有很高的纤维纯度，纤维素含量在99%以上。由于纤维丝束间大量的氢键存在，使其具有较高的抗张强度和弹性模量。经处理后，杨氏模量可达（78±17）GPa[9]。BC分子内存在大量的亲水性基团，有很多“孔道”，因此具有良好的透气、透水性能，能吸收比自身干重大60～700倍的水分。BC具有极佳的形状维持能力和抗撕裂性，较高的生物适应性和良好的生物可降解性，可最终降解成单糖等小分子[10]。

不同的培养条件下得到的BC，其结构和性质有很大差异，即BC在生物合成时具有良好的性能和形状的可控性。如将壳聚糖添加于Acetobacter xylinum的培养基中对合成的BC进行改性，可使得这种改性的纤维素不仅具有纤维素本身的特性还具有壳聚糖的特性，在处理烧伤、褥疮以及组织工程应用等方面具有良好的应用价值[11]。近期，Honglin等[12]报道了将胶原加入培养基中得到了一种新的潜在的组织工程支架材料，胶原-细菌纤维素（COL/BC）复合材料，研究表明这种材料结构和性能优于单纯的BC材料。

BC在合成过成中可以任意塑形，并且不会导致其物理性能的变化。通过模板或特定的培养装置可以控制BC材料的形状。R oberts等首先申请了关于BC成形培养的专利，他们将Acetobacter放入一个特制的具有氧渗透性能的聚合物（如：聚氯乙烯）模具中，作为发酵装置模具的一侧与氧气接触，另一侧与培养液接触。通过这一静态培养装置，可以合成各种三维形状的BC材料。White等[13]利用Acetobacter在培养过程中直接形成一种无缝手套形状的BC产品，用来治疗烧伤的手部皮肤。Yasumitsu等[14]使用琼脂作为模板，通过控制细菌的运动，制备出了具有蜂窝状结构的BC膜。最近Backdahl等[15]分别使用淀粉、石蜡作为致孔剂，制备出具有一定孔径的三维组织工程血管支架材料，材料孔径、厚度、连通性均可通过改变致孔剂的尺寸和发酵条件来控制。BC良好的塑形性使得其作为组织工程支架时，可以更好地控制孔径与孔隙率以满足不同组织构建时的需要。

生物相容性是作为组织工程支架材料必备的要素之一。许多研究人员做了BC动物模型的体内相容性研究。例如，Kolodziejczyk等在兔子皮下植入BC膜（直径1 cm），3周后观察，无肉眼可见的炎症反应，组织学观察显示只有少量的巨细胞和成纤维细胞出现在材料组织界面上。Klemm等[16]的研究同样证实了BC良好的体内相容性，他们将一段中空的BC管植入鼠颈动脉，无排异反应。Helenius等[17]在Wistar大鼠皮下植入BC，使用免疫组化和电子显微镜技术，经过1～12周观察，从慢性炎症反应、异物排斥反应，以及细胞向内生长和血管生成等方面的特征，系统评估了植入BC的体内相容性。结果表明，BC周围无肉眼和显微镜可见的炎症反应，没有纤维化被膜和巨细胞生成，而且与宿主组织融为一体，未引起任何慢性炎症反应，同时还观察到，许多成纤维细胞可以透过BC材料的多孔结构进入材料内部，并且有成纤维细胞增殖和胶原合成，因此可以断定BC的生物相容性良好，在组织工程化组织构建方面具有潜在的价值。马霞等[18]报道了以BC作为创伤辅料的研究，也发现BC膜表面孔径具备作为人工皮肤支架的物理条件，适于成纤维细胞和毛细血管的长入。BC为新生的毛细血管和成纤维细胞提供了合适的三维支架，利于其长入和定位，并可诱导成纤维细胞生长，利于肉芽组织的生成。

2 在组织工程中的研究进展

2.1 软骨组织工程

在软骨组织工程研究中，为了支持细胞增殖，确定新生组织的特定形状，并且维持细胞分化功能，必须使用三维的支架材料。许多天然材料与合成聚合物已经被广泛研究，但这些材料的机械性能不甚理想。BC以其独特的性能、在湿态时优异的力学性能、原位可塑性开始受到关注。Svensson等[18]利用牛软骨细胞对天然BC材料和经化学修饰的BC材料进行了评价，结果表明，未经修饰的天然BC材料在保持良好的机械性能的前提下，Ⅱ型胶原基质可达到正常软骨表达的50%左右，并且支持软骨细胞的增殖。与细胞培养用的培养皿材料和藻酸钙相比，天然BC中培养的软骨细胞表现出明显的高水平生长，说明BC材料能更好地支持软骨细胞生长、增殖。通过体外巨噬细胞屏蔽实验发现，BC未导致显著性的致炎细胞因子活化。透射电镜分析及人软骨细胞Ⅱ型胶原RNA表达分析表明，天然BC支持软骨细胞的分化、增殖。此外，软骨细胞向支架材料内部的长入也已通过透射电镜得到证实。因此，BC材料具有作为软骨组织工程支架材料的可能。Bodin等[20]用硅树脂作为模具，制备出半月板形状的BC材料，并以猪的半月板、已用于临床半月板修复的胶原质材料作为对照，评价了3种材料的力学性能。结果表明，BC材料的力学性能优于胶原质材料，其杨氏模量约是胶原质材料的100倍，压缩模量与猪的半月板相似。综合BC材料的优异力学性能，良好的塑形性能，并且维持软骨分化、支持软骨细胞的迁移增殖，BC材料在软骨组织工程构建方面有着极大的潜力。

2.2 血管组织工程

小口径的组织工程血管的移植为微脉管手术等治疗血管疾病提供了有效的途径。早在2001年，Klemm等[16]就报道了一种利用Acetobacter xylinum原位成形制备的BC应用于显微外科手术的人工血管。这种称为BASYC（BActerial SYnthesized Cellulose）的人造血管具有极强的亲水性，光滑的内表面，在湿态下足够的机械强度，以及良好的生物活性等特性，在显微外科中作为人工血管有着巨大的应用前景。Backdahl等[21]评价了BC作为潜在的组织工程血管支架的可行性。研究显示平滑肌细胞可以在BC膜上黏附、增殖，并向内部生长。TEM显示平滑肌细胞在体外培养2周后可向内生长约40 μm。同时，他们利用SEM观察了静态培养的BC膜生长形态学，并比较了BC、猪动脉和膨体聚四氟乙烯支架在机械性能上的差异，发现BC与动脉相似。众所周知，BC膜在静态原位培养时，有两个不同结构的表面。作为下表面的气/液接触面结构较为密集、表面相对平滑，而上表面为结构较呈疏松的多孔形态。根据这一独特结构，Backdahl提出在BC作为血管支架时，可以在气/液面上接种内皮细胞，因为研究表明，内皮细胞在光滑面的黏附性更好。Bodin等[22]研究了Acetobacter xylinum原位静态培养时不同浓度的氧含量对BC管机械性能的影响，证明BC管可承受大于25 mmHg（1 mmHg=0.133 KPa）的血压，在最佳的培养条件下，爆破压力可达到880 mmHg。同时在BC管内腔种植人内皮细胞，7 d后细胞融合成片，说明了BC材料可以提供内皮细胞良好的黏附增殖。这种以细胞纤维素作为组织工程血管支架的相关大动物模型正在研究中。近期Backdahl等[15]报道了分别以淀粉和石蜡微球为致孔剂制备出用于血管组织工程的BC支架材料，通过改变致孔剂的粒径可以控制支架材料的孔径。在BC支架材料上种植人平滑肌细胞，与静态培养的BC膜相比，孔径三维结构的支架材料内部有更多的细胞迁入。

2.3 骨组织工程

骨组织是由无机材料和有机材料结合在一起形成的复合体，其中无机材料的大部分是磷灰石，有机物质大部分为纤维性胶原蛋白。羟基磷灰石[HAp，Ca10(PO4)6(OH)2]作为一种化学组成和晶体结构类似于骨组织磷灰石的生物材料，具有良好的生物活性、生物相容性和骨传导性，被广泛用于骨组织工程的研究[23]，但其存在颗粒较大、结晶度较大、生物力学强度较低等缺陷。有许多研究尝试将HAp与天然材料（如：胶原、壳聚糖、甲壳素、明胶、蚕丝蛋白等［24－28］）复合以满足临床应用的需要，但这些复合材料的生物力学性能并不令人满意。BC结构与骨胶原纤维的形态形似，并且具有卓越的力学强度，使其应用于骨组织工程研究成为可能。Wan等[29]对HAp和BC复合进行了研究，发现经过磷酸盐和氯化钙处理后的BC材料在模拟体液中可以形成HAp的结晶。进一步的研究显示，磷酸化的BC可以促进HAp形成，并且形成的HAp晶体是被碳酸盐包裹的纳米级、低结晶度晶体[30]。这种三维HAp-BC纳米复合结构类似于骨骼中的生物磷灰石，在骨组织工程支架应用方面具有良好的发展前景。Hutchens等[31]以BC为生物陶瓷的沉积基质，合成了一种相似的低钙羟基磷灰石（Calcium-deficient hydroxyapatite，CdHAP）复合材料。在生理pH值和温度下，通过先在氯化钙溶液中连续培养，然后再在磷酸钠中孵育，最终在BC上形成了磷酸钙微粒。XRD表征结果显示，10～50 nm的晶体颗粒在BC中形成，并且形成的晶体颗粒为各向异性轴向拉伸片晶，这种低钙磷灰石与骨的主要组分相似。SEM证实了在纤维素中形成的是由片层状的纳米晶体组成的均一的低钙羟基磷灰石微球，微球直径约为1 μm。在研究中发现这种复合材料比天然的BC能更好地支持成骨细胞的生长。Hutchens指出这种模拟天然生物矿化骨的复合材料使有望成为整形外科的一种优良生物材料，可以作为骨再生治疗的植入物，并且有望成为骨组织工程支架材料而应用于骨组织的构建。

2.4 组织工程其他方面的应用

Sanchavanakit等[32]研究了人的角化细胞和成纤维细胞在BC上的体外培养状况，结果表明，BC对人的角化细胞和成纤维细胞没有毒性，并且支持两种细胞的增殖。对人的角化细胞，BC材料与培养皿材料相比，可以更好地支持细胞的黏附、增殖及迁移，并且可以很好地维持角质细胞的表达。对成纤维细胞，虽然支持细胞的增殖及迁移，但BC材料使得成纤维细胞的黏附性较差。因此，BC材料作为组织工程皮肤支架材料，需要进行修饰及改性以满足皮肤组织构建的需要。

3 结束语

BC作为一种优良的生物材料，由于其良好的体内、外生物相容性和独特的机械性能，使其可作为一种潜在的组织工程支架材料应用于多种组织构建中。与其他生物材料相比，BC材料用于组织工程学的研究还处于初始阶段，大动物模型体内的生物相容性研究还未见报道，体外的材料-细胞复合物的长期观察、材料降解速率与构建组织的匹配等都需要进一步的深入研究。

[1]Czaja W,Krystynowicz A,Bielecki S,et al.Microbial cellulosethe natural power to heal wounds[J].Biomaterials,2006,27:145-151.

[2]Fontana JD,de Sousa AM,Fontana CK,et al.Acetobacter cellulose pellicle as a temporary skin substitute[J].Appl Biochem Biotechnol, 1990,24-25:253-264.

[3]Alvarez O,Patel M,Booker J,et al.Wounds:a compendium of clinical research and practice[J].2004,16:224-233.

[4]Klemm D,Schumann D,Udhardt U,et al.Bacterial synthesized cellulose-aetificial blood vessels for microsurgery[J].Prog Polym Sci,2001,26:1561-1603.

[5]Mello LR,Feltrin LT,Neto PTF,et al.Duraplasty with biosynthetic cellulose:an experimental study[J].J Neurosurg,1997,86:143-150.

[6]dos Anjos B,Novaes AB Jr,Meffert R,et al.Clinical comparison of cellulose and expanded polytetrafluoroethylene membranes in the treatment of class II furcations in mandibular molars with 6 month re-entry[J].J Periodontol,1998,69(4):454-459.

[7]Ross P,Mayer R,Benziman M,et al.Cellulose biosynthesis and function in bacteria[J].Microbiol Rev,1991,55:35-38.

[8]Czaja W,Romanovicz D,Brown RM.Structural investigations of microbial cellulose produced in stationary and agitated culture [J].Cellulose,2004,11:403-411.

[9]Guhados G,Wan W,Hutter JL.Measurement of the elastic modulus of single bacterial cellulose fibers using atomic force microscopy [J].Langmuir,2005,21:6642-6646.

[10]Yano H,Sugiyama J,Nakagaito AN,et al.Optically transparent composites reinforced with networks of bacterial nanofibers[J]. Adv Mater,2005,17:153-155.

[11]Ciechańska D.Multifunctional bacterial cellulose/chitosan composite materials for medical applications[J].Fibres Text East Eur,2004, 12(4):69-72.

[12]Luo HL,Xiong GY,Huang Y,et al.Preparation and characterization of a novel COL/BC composite for potential tissue engineering scaffolds[J].Materials Chemistry and Physics,2008,110:193-196.

[13]White DG,Brown RM Jr.Prospects for the commercialization of the biosynthesis of microbial cellulose.In:Schuerch C.Cellulose and wood chemistry and technology[M].New York:John Wiley& Sons,1989,573-590.

[14]Uraki Y,Nemoto J,Otsuka H,Honeycomb-like architecture produced bylivingbacteria,gluconacetobacterxylinus[J].CarbohydratePolymers, 2007,69:1-6.

[15]Backdahl H,Esguerra M,Delbro D.Engineering microporosity in bacterial cellulose scaffolds[J].J Tissue Eng Regen Med,2008,2: 320-330.

[16]Klemm D,Schumann D,Udhardt U,et al.Bacterial synthesized cellulose-artificial blood vessels for microsurgery[J].Prog Polym Sci,2001,26:1561-1603.

[17]Helenius G,Baeckdahl H,Bodin A,et al.In vivo biocompatibility of bacterial cellulose[J].J Biomed Mater Res,2006,76(2):431-438.

[18]马霞,陈世文,王瑞明.纳米材料细菌纤维素对大鼠皮肤创伤的促愈作用[J].中国临床康复,2006,10(37):45-47.

[19]Svensson A,Nicklasson E,Harraha T,et al.Bacterial cellulose as a potential scaffold for tissue engineering of cartilage[J].Biomaterials, 2005,26:419-431.

[20]Bodin A,Concaro S,Brittberg M.Bacterial cellulose as a potential meniscus implant[J].J Tissue Eng Regen Med,2007,1:406-408.

[21]Backdahl H,Helenius G,Bodin A.Mechanical properties of bacterial cellulose and interactions with smooth muscle cells[J].Biomaterials, 2006,27:2141-2149.

[22]Bodin A,Backdahl H,Fink H.Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes[J].Biotechnology and Bioengineering,2007,97(2):425-434.

[23]Ono I,et al.In vivo strength enhancement of hydroxyapatite combined with rhBMP-2[J].J Bone Miner Metab,1998,16:81-87.

[24]Kikuchi M,Ikoma T,Itoh S,et al.Biomimetic synthesis of bonelike nanocomposites using the self-organization mechanism of hydroxyapatite and collagen[J].Compos Sci Technol,2004,64(6): 819-825.

[25]Hu Q,Li B,Wang M,et al.Preparation and characterization of biodegradable chitosan/hydroxyapatite nanocomposite rods via in situ hybridization:a potential material as internal fixation of bone fracture[J].Biomacterial,2004,25:779-785.

[26]Wan ACA,Khor E,Hastings GW.Hydroxyapatite modified chitin as potential hard tissue substitute material[J].J Biomed Mater Res,1997,38:235-241.

[27]Chang MC,Ko CC,Douglas WH.Preparation of hydroxyapatitegelatin nanocomposite[J].Biomaterials,2003,24:2853-2862.

[28]Furuzono T,Taguchi T,Kishida A.Preparation and characterization of apatite deposited on silk fabric using an alternate soaking process [J].J Biomed Mater Res,2000,50:344-352.

[29]Wan YZ,Hong L,Jia SR,et al.Synthesis and characterization of hydroxyapatite-bacterial cellulose nanocomposites[J].Compos Sci Techol,2006,66:1825-1832.

[30]Wan YZ,Huang Y,Yuan CD,et al.Biomimetic synthesis of hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposites for biomedical applications[J].Mater Sci Eng C,2007,27:855-864.

[31]Hutchens SA,Benson RS,Evans BR.Biomimetic synthesis of calcium-deficient hydroxyapatite in a natural hydroge[J]. Biomaterials,2006,27:4661-4670.

[32]Sanchavanakit N,Sangrungraungroj W,Kaomongkolgit R,et al. Growth of human keratinocytes and fibroblasts on bacterial cellulose film[J].Biotechnol Prog,2006,22(4):1194-1199.

TQ352.7

B

1673－0364（2009）－02－0111－03

2009年1月8日；

2009年2月23日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.04.017

教育部新世纪人才计划(NCET-05-0420)，高等学校学科创新引智基地(111-2-04,B07024),上海市重点学科建设项目资助(B603)。

201620上海市东华大学纤维材料改性国家重点实验室，东华大学材料科学与工程学院。