Cldn14基因敲除对大鼠草酸钙结石诱导形成的影响及其机制

Effects of Cldn14 gene knockout on the formation of calcium oxalate stones in rats and its mechanism

LUO Peiyue^1，2，ZHENG Liying¹，CHEN Tao^1，2，ZOU Jun^1，2，LI Wei^1，2，CHEN Qi^1，2，CHENG Le^1，2，GAN Lifeng^1，2，ZHANG Fangtao^1，2，QIAN Biao^1，2

（1.Department of Urology，The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Ganzhou 341000; 2.Key Laboratory of Urology and Andrology of Ganzhou，Ganzhou 341000，China）

ABSTRACT：Objective To explore the effects of Cldn14 gene knockout on renal metabolism and stone formation in rats，so as to provide reference for research in the field of urinary calium metabolism and stone formation.Methods Cldn14 gene knockout homozygous rats and wild-type rats of the same age were randomly divided into 4 groups：wild-type control （WC） group，wild-type ethylene glycol （WE） group，gene knockout control （KC） group and gene knockout ethylene glycol （KE） group，with 10 rats in each group.The WE and KE groups were induced with ethylene glycol + ammonium chloride to form kidney stones，while the WC and KC groups received normal saline gavage.After 4 weeks of standard maintenance feeding，the urine samples were collected to detect the venous blood.The kidneys were collected for HE，Pizzolattos staining and transmission electron microscopy.The protein in renal tissues was extracted to detect the expressions of Claudin16 and Claudin19.Results Crystal deposition was observed in the renal tubular lumen of the WE and the KE groups，and more crystals were detected in the KE group.The WE group had a large number of intracytoplasmic black crystalline inclusions observed in renal tubular epithelial cells under transmission electron microscope，followed by the KE and KC groups.Compared with WC and WE groups，KC and KE groups had significantly decreased serum calcium and magnesium levels but significantly increased urinary calcium level.In addition，the urinary calcium level was higher in the WE group than in the WC group and higher in the KE group than in the KC group.The KE group had lower level of Claudin16，but there was no significant difference in the level of Claudin19 among the 4 groups（P＞0.05）.Conclusion Knockout of Cldn14 gene alone cannot effectively reduce urinary calcium excretion or reduce the risk of stone formation in rats，which may be related to the decrease of Claudin16 level.

KEY WORDS：urinary calium metabolism；molecular biology；Cldn14 gene; kidney stones; tight junction protein; ethylene glycol

摘要：目的 探究紧密连接蛋白14（Cldn14）基因敲除对大鼠肾脏代谢及结石诱导形成的影响及其机制，为尿钙代谢及结石领域研究提供参考。方法 将野生型大鼠与同周龄Cldn14基因敲除的纯合子大鼠分别随机分为野生型对照（WC）组、野生型乙二醇（WE）组、基因敲除对照（KC）组及基因敲除乙二醇（KE）组，每组10只。其中WE、KE组采用乙二醇+氯化铵方式诱导肾结石形成，WC和KC 组采用生理盐水灌胃。标准维持饲料喂养4周后收集大鼠尿液，并进行静脉血检测，同时收集大鼠肾脏行HE、钙盐染色及透射电镜观察并提取肾组织蛋白。采用蛋白质印迹法检测紧密连接蛋白16（Claudin16）及紧密连接蛋白19（Claudin19）的表达水平。结果 WE组与KE组肾小管腔内均可见晶体沉积，且KE组晶体多于WE组；相比于KC组，KE组在透射电镜下的肾小管上皮细胞中可见大量胞质内黑色结晶性包涵体，而WE组包涵体数量显著多于KE组。相比于WC和WE组，KC和KE组大鼠的血钙及血镁水平显著降低而尿钙水平则明显升高。此外，WE组相对于WC组、KE组相对于KC组尿钙水平进一步上升。KE组大鼠肾脏组织Claudin16水平显著降低，然而四组大鼠肾脏组织Claudin19水平差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论 单纯敲除Cldn14基因并不能有效减少大鼠尿钙排泄及降低结石形成的风险，这可能与Claudin16水平降低有关。

关键词：尿钙代谢；分子生物学；Cldn14基因；肾结石；紧密连接蛋白；乙二醇

中图分类号：R691.4

文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2025.02.015

钙性结石是临床最常见的肾结石类型^［1］。尽管病因复杂，但已有充分的证据表明，高钙尿症是引起肾结石的主要危险因素^［2］。尿钙水平对结石形成有着重要的影响，研究表明，超过60%的钙离子通过由紧密连接家族蛋白（Claudins）组成的细胞旁途径通道被重吸收，因此Claudin蛋白可能成为结石防治的潜在靶点^［3］。近年来多项基因关联性研究发现，紧密连接蛋白14（Cldn14）基因突变与人类遗传性高钙尿症及钙性结石形成有着密切的联系^［4-5］。此外，通过动态检测肾脏组织Claudin 14水平发现，在乙二醇及纳米细菌诱导大鼠肾结石形成的过程中，Claudin14水平显著升高^［6-8］。上述结果均表明Claudin14在尿钙排泄及结石形成过程中具有重要作用，但Claudin14在调节尿钙代谢及结石形成中的具体作用机制暂未阐明。本研究通过构建Cldn14基因敲除大鼠并诱导肾结石形成，同时检测血、尿生化及肾脏结晶形成及损伤变化，拟进一步明确Claudin14在大鼠肾脏代谢及结石诱导形成中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 野生型雄性Wistar大鼠购于长沙天勤生物技术有限公司［许可证号：SCXK（湘）2014-0010；合格证编号：No.202230760］，Cldn14基因敲除杂合子大鼠购自苏州赛业生物科技有限公司［许可证号：SCXK（粤）2020-0055；合格证编号：No.44826100001973］，饲养条件为恒温、恒湿，大鼠自由饮食、饮水。本研究经赣南医科大学伦理委员会审核：［2016］院伦审动实字（001）号（NO）A2016-001，所有动物操作均遵守动物实验伦理准则。

1.1.2 主要实验仪器及试剂 标准饲料、垫料（赣南医科大学实验动物中心），DNA提取试剂盒、琼脂糖（北京全式金），50×TAE缓冲液（中国百凯美），乙二醇、氯化铵（美国Sigma），戊巴比妥钠（德国Merck），HE染色试剂盒、戊二醛（北京索莱宝），紧密连接蛋白16（Claudin 16）、紧密连接蛋白19（Claudin 19）多克隆抗体（美国赛默飞），β-actin多克隆抗体（中国Proteintech），超敏ECL发光液（武汉Elabscience），全自动生化分析仪（瑞士罗氏），全自动脱水机、病理切片机（美国赛默飞），偏光显微镜（中国瞬宇），聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪（美国AB），电泳仪（北京六一），凝胶成像系统（德国耶拿）。

1.2 实验方法

1.2.1 Cldn14基因敲除大鼠的基因型鉴定 耳标标记待测大鼠，并使用动物打孔器于大鼠耳缘打孔取样，将取得组织放入无核酶EP管内，使用DNA提取试剂盒提取组织DNA，根据gRNA的作用位点设计2条前导链引物F1、F2及1条后随链引物R1，PCR引物序列见表1。使用F1与R1配置扩增体系1，F2与R1配置扩增体系2并对提取的DNA进行PCR扩增，将扩增产物加入10 g/L琼脂糖凝胶，采用直流电150 V电泳50 min后凝胶成像系统对DNA条带进行显像，根据不同分子质量DNA条带数量确定待鉴定大鼠的基因型（野生型、杂合子及纯合子分别有2条、3条及1条DNA带）。

1.2.2 动物分组及草酸钙结石模型的建立 选取周龄、体质量相匹配的雄性野生型Wistar大鼠及Cldn14基因敲除大鼠各20只，随机分为野生型对照（WC）组及野生型乙二醇（WE）组、基因敲除对照（KC）组及基因敲除乙二醇（KE）组，每组10只。适应性饲养1周后，成石组（WE和KE组）自由饮用10 g/L的乙二醇蒸馏水，造模的最后1周使用10 g/L氯化铵溶液1 mL/（kg·d）灌胃，对照组（WC和KC组）自由饮用蒸馏水并于造模最后1周使用生理盐水1 mL/（kg·d） 灌胃，造模共持续28 d。

1.2.3 大鼠组织样本收集及检测 标准维持饲料喂养4周后，将大鼠置于代谢笼，收集24 h尿液后麻醉，切开腹腔，采集静脉血3～4 mL，将尿液、血液离心后取上清液置于全自动生化分析仪检测。原位肾灌注清洗肾脏后取出，将一侧肾脏沿长轴切开，福尔马林固定24 h后脱水、包埋、切片、脱蜡后行HE及钙盐（Pizzolattos法）染色。肾组织切成1 mm³小块并置于戊二醛溶液固定24 h，脱水、渗透包埋、聚合、切片、染色后通过透射电镜观察。另一侧肾脏留取皮髓交界处组织，加入裂解液提取此部分组织蛋白，利用蛋白质印迹（Western blotting，WB）检测Claudin16及Claudin19蛋白的表达水平。

1.3 统计学方法 所有数据均使用IBM SPSS 26.0软件进行统计学分析，所有统计图均使用GraphPad Prism软件绘制。计量资料采用±s表示，正态性检验后若数据符合正态分布，对多组间比较采用One-way ANOVA方差分析，两组间比较采用独立样本t检验，若数据不符合正态分布则采用非参数检验。Plt;0.05为差异具有统计学意义。2 结 果

2.1 Cldn14基因敲除大鼠鉴定 经CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的Cldn14基因敲除亲代雌、雄大鼠均为杂合子，其子代可出现野生型、杂合子及纯合子3种表型。因此，需通过基因鉴定筛选出实验造模所需的Cldn14基因敲除纯合子大鼠。如图1A所示，亲代大鼠DNA经2种PCR体系扩增后产物包含659 bp、720 bp及2698 bp 3条DNA带，鉴定为杂合子。而选取的3只子代大鼠的DNA扩增产物均仅有1条720 bp带，为Cldn14基因敲除纯合子。进一步通过WB检测野生型大鼠及鉴定为纯合子的Cldn14基因敲除大鼠肾脏组织Claudin14蛋白表达水平，如图1B所示，野生型大鼠可检测出清晰的Claudin14蛋白条带，而鉴定为纯合子的大鼠肾脏组织几乎无Claudin14表达。通过以上鉴定及筛选方式，我们成功繁育并筛选出20只Cldn14基因敲除纯合子大鼠用于后续实验。

2.2 各组大鼠肾脏组织病理检测结果 HE染色切片观察，WC组与KC组均未见晶体沉积，肾单位结构清楚，皮质、髓质分界清晰，两组大鼠肾脏病理结构无显著差异。而WE组与KE组大鼠肾小管腔内均可见晶体沉积，并伴有不同程度的肾小球萎缩、肾小管上皮细胞坏死脱落以及炎症细胞浸润，但两组大鼠肾脏晶体含量及肾脏损伤程度有显著差异。相比于WE组，KE组管腔内晶体数量进一步增多，肾小管扩张程度以及肾小管上皮细胞水肿坏死程度进一步增加；钙盐染色WC组与KC组均未见阳性染色，而WE组与KE组管腔内可见黄褐色草酸钙晶体，KE组较WE组更为明显（图2）；透射电镜观察肾小管上皮细胞，相比于对照组，成石组的大鼠除线粒体明显水肿外，胞质内还可见大量黑色结晶性包涵体，然而与管腔内晶体不同的是，WE组包涵体数量显著多于KE组（图3）。

2.3 大鼠血、尿生化检测分析 检测4组大鼠血液及尿液钙、镁、磷水平。结果发现，在给予正常钙水平饲养4周后，相比于WC和WE组，KC和KE组大鼠的血钙及血镁水平显著降低，尿钙水平明显升高（P均lt;0.01）。此外，WE组相对于WC组尿钙水平进一步升高，KE组相对于KC组尿钙水平也显著上升（Plt;0.01），而血钙水平WC与WE、KC与KE相比差异均无统计学意义（Pgt;0.05，表2）。

2.4 各组大鼠肾脏组织Claudin16及Claudin19表达水平 采用WB检测Claudin16及Claudin19的表达水平，结果显示相比于WC组，KC组大鼠肾脏组织Claudin16水平显著降低而Claudin19水平差异无统计学意义。WE组较WC组、KE组较KC组的Claudin16水平均有所降低（Plt;0.01），然而Claudin19表达水平在对照组与成石组间的差异均无统计学意义（Pgt;0.05，图4）。

3 讨 论

Claudin家族作为紧密连接过程重要的参与者在调节离子细胞旁途径通透性中起到关键作用^［9］。特定种类及数量的Claudins赋予了肾小管不同节段对离子的通透效果^［10］。研究不同Claudins的功能作用的一个有效的方法是构建一个相应的Cldn基因敲除动物模型，ELKOUBY-NAOR等^［11］构建了Cldn11/14双基因敲除小鼠，检测结果发现，两组大鼠血浆钙离子、镁离子及肌酐水平差异均无统计学意义，尽管基因敲除小鼠的尿镁与尿钙的排泄量较高，但与野生型相比，这些变化并无统计学意义。但GONG等^［12］的研究得出相反的结果，野生型及单纯Cldn14基因敲除小鼠在给予高钙饮食10周后，尿钙、尿镁排泄及血浆镁相对于野生型显著降低，而血浆钙离子浓度则无显著变化。与上述基因敲除小鼠模型一样，本研究构建的Cldn14基因敲除大鼠可以正常稳定繁育，未发现严重的生理变化。通过检测发现相对于野生型大鼠，Cldn14基因敲除大鼠在正常钙饮食4周后血钙、血镁水平显著降低而尿钙、尿镁水平显著增高，提示尿液钙离子、镁离子出现过度排泄，而通过使用乙二醇诱导后，与野生型一样，基因敲除大鼠的尿钙水平也进一步升高，表明尿钙排泄水平在Claudin14缺失的情况下还可被进一步诱导。多项类似的研究却出现不同的实验结果，除了受如降钙素水平、饮食钙水平等外在因素影响外，这一结果也提示尿钙、尿镁代谢可能涉及更为复杂的调控机制，即Claudin14可能与其他分子相互作用共同参与尿钙、尿镁代谢。

近年来，Claudin14因其在钙离子代谢中的关键作用不断在泌尿系结石领域被广泛研究。早在2009年，一项全基因组关联性研究证实了Cldn14基因突变与肾结石形成有着密切的联系^［4］，印度的一项基因调查研究中也证实了同样的结果^［13］。此外，多项研究表明在乙二醇及纳米细菌诱导的肾结石形成过程中，Claudin14的水平显著升高^［6-8］。进一步研究发现，Claudin14水平的升高会导致肾小管对钙离子的重吸收受到抑制，从而导致尿液中钙离子的排泄增加，增加了肾结石形成的风险^［14-15］。为进一步验证Claudin14在结石形成中的作用，我们构建了Cldn14基因敲除大鼠并使用乙二醇诱导结石形成。然而结果与预期并不一致，乙二醇仍可诱导Cldn14基因敲除大鼠肾结石形成，结石形成程度及肾脏损伤程度甚至比野生型更严重。我们认为这一结果并不能否认Cldn14基因在诱导结石形成中的作用，因已经有研究证实，Claudin家族蛋白之间存在功能冗余，即尿钙调节并不是由单一分子实现的^［11］。Claudin14作为肾钙代谢调节中的一员，其缺失并不一定能造成肾钙代谢的功能紊乱，本研究的尿钙检测结果也证实了这一点，即Claudin14蛋白缺失后，尿钙水平并没有像预测的那样显著降低而是进一步升高，导致血清钙浓度显著下降。因此我们进一步检测了与Claudin14关联密切的Claudin16及Claudin19的水平。

研究表明Claudin16及Claudin19主要在肾脏的髓袢升支粗段（ascending thick limb of Henles loop，TAL）表达，二者以异二聚体的形式形成阳离子通道，以便在此处通过细胞旁途径重吸收钙离子和镁离子^［5］。GONG等^［12］的研究证实，Claudin 14同样定位于TAL段，并通过与Claudin16直接作用从而抑制阳离子通道的活性进而降低钙、镁的重吸收。正常情况下由于miRNA的存在Claudin14低表达，在受到胞质外高钙离子浓度激活后人源钙离子敏感受体诱导TAL段Claudin14表达升高，并通过抑制Claudin16/19离子通道从而促进尿钙、镁的排泄^［16-17］。我们通过WB检测了各组大鼠肾脏组织Claudin16及Claudin19的表达，结果发现Claudin14蛋白缺失后Claudin16的水平也显著降低，而Claudin19的表达水平则无显著变化，这一结果与GONG等^［12］研究的结论一致，Claudin14是与Claudin16直接作用而并不与Claudin19直接结合。同时也对这一结果进行了侧面补充，即Claudin14不仅能与Claudin16直接作用影响其异二聚体阳离子通道的通透性，同时还可以直接影响Claudin16的表达水平从而通过减少阳离子通道的形成抑制尿钙、镁的重吸收。因此，尿钙排泄的进一步升高以及结石形成的进一步加重也可能与Claudin16水平的显著降低密切相关。

总而言之，本研究证实了单纯敲除Cldn14基因并不能有效减少尿钙排泄并降低结石形成的风险，这可能与Claudin16的水平降低相关，也可能涉及更为复杂的调控机制。进一步探索与Claudin14协同参与尿钙代谢及结石形成的相关分子可成为后续研究的新方向。

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（编辑 郭楚君）