淡绿杜洛埃藻(Drouetiella lurida)
2025-03-04王捷张婷蔡芳芳董建新李艳晖刘琪
摘 要：杜洛埃藻属（Drouetiella Mai， Johansen amp; Pietrasiak）中的物种具有形态可塑性，容易与细点丝藻科（Oculatellaceae）的其他物种混淆，该属中的藻株从陆地生物群落中分离，采用包括分子手段、形态特征和生态信息相结合的多相方法进行表征.从中国西藏自治区拉萨市的潮湿土壤分离出一株丝状蓝藻，编号为SXACC0052，形态上与淡绿杜洛埃藻（Drouetiella lurida（Gomont） Mai， Johansen amp; Pietrasiak）相似，藻丝都呈现橄榄绿色，有无色且坚固的鞘，横壁不收缩或稍微收缩，没有观察到假分枝.16S rRNA基因与16S-23S rRNA ITS序列显示出这株蓝藻与淡绿杜洛埃藻有较高的相似度，并且在系统发育树中聚为一支，步展值分别为98/78/1和85/99/0.89.此外，这株丝状蓝藻的ITS二级结构与淡绿杜洛埃藻的结构相似度较高，进一步表明这株丝状蓝藻属于淡绿杜洛埃藻.杜洛埃藻属是我国首次报道的新记录属，淡绿杜洛埃藻是我国首次报道的新记录种.该种的发现丰富了我国蓝藻物种多样性，为保护和持续了解藻种资源提供理论依据.
关键词：淡绿杜洛埃藻；西藏；蓝藻；新记录；系统发育
中图分类号：Q949.22""""" 文献标志码：A文章编号：1000-2367（2025）02-0063-10
蓝藻也称为蓝细菌，是一种光合自养生物，通常被认为是最重要的初级生产者［1］.蓝藻分布广泛，由于能分化出特殊的细胞（如异形胞和厚壁孢子），可以在极端环境中生存［2］.欧洲和亚洲对蓝藻的研究有着悠久的历史［3］，但某些地区蓝藻的多样性仍然被低估.我国对蓝藻的研究主要集中在水华蓝藻的治理［4］、蓝藻多糖提取［5］、蓝藻食品［6］以及蓝藻分类鉴定［7］等方面.在江西、云南、山西、重庆、四川等地区对蓝藻的几项研究表明［8-10］，我国的蓝藻类群还有许多未发现的物种，进一步探索我国蓝藻的物种多样性是十分必要的.
在现代蓝藻分类学中，单系属是利用基因、形态和生态学数据建立的［11］.基于这种多相分类方法，STRUNECKY′等［12］在2023年已经建立了一个新的蓝藻分类系统，目前包括20个目，800多个属和5 000个分类单元.近年来，丝状蓝藻经历广泛的分类学修订，特别是有争议的细鞘丝藻科（Leptolyngbyaceae），很多蓝藻在早期被划分到该科中［13-14］，直到MAI等［15］在2018年将细鞘丝藻科又进一步划分为Oculatellaceae和Trichocoleaceae，同时描述了6个新属，分别是Cartusia、Drouetiella、Kaiparowitsia、Komarkovaea、Pegethrix和Tildeniella，细鞘丝藻科的分类修订为实现蓝藻的单系属奠定基础.随后的分类学研究将Oculatellaceae科
收稿日期：2024-03-20;修回日期：2024-04-15.
基金项目：国家自然科学基金（31970217;32000166）;山西省应用基础研究计划（面上项目）（20210302124302）;中央水生态环境保护专项项目（拉萨河流域水生态调查评估）.
作者简介：王捷（1984-），男，山西河曲人，太原师范学院副教授，博士，研究方向为藻类分类及系统演化，E-mail：nostoc@126.com.
通信作者：刘琪，山西大学教授，博士，博士生导师，E-mail：liuqi@sxu.edu.cn.
引用本文：王捷，张婷，蔡芳芳，等.淡绿杜洛埃藻（Drouetiella lurida）——分离自中国西藏的蓝藻新记录种［J］.河南师范大学学报（自然科学版），2025，53（2）：63-72.（Wang Jie，Zhang Ting，Cai Fangfang，et al.Drouetiella lurida：a new record species of cyanobacteria isolated from Xizang，China［J］.Journal of Henan Normal University（Natural Science Edition），2025，53（2）：63-72.DOI：10.16366/j.cnki.1000-2367.2024.03.20.0003.）
中的已知属增加到了21个［12］，但是由于缺乏清晰的形态学特征，这些新种和新属很难通过光学显微镜进行准确鉴定.
杜洛埃藻属是由MAI等［15］在2018年建立的新属，属于细点丝藻目（Oculatellales）细点丝藻科（Oculatelaceae），目前有5个种被有效描述，模式种是淡绿杜洛埃藻.该属具有单个假分枝，具有无色坚固的鞘，在横壁处稍微收缩，末端细胞圆柱形.在区分新属杜洛埃藻属的过程中，MAI等［15］描述了2个新种Drouetiella fasciculata和Drouetiella hepatica，作者还将Phormidium lurandum分到杜洛埃藻属中，之后KIM等［16］从韩国大邱广域市的石碑上分离出了Drouetiella epilithica，DAVYDOV等［17］也从俄罗斯科米共和国的乌拉尔山分离并描述了一个新种Drouetiella ramosa.在系统发育分析中杜洛埃藻属具有单独的进化枝，具有与其他物种不同的二级结构，还有许多未定种的序列如Drouetiella sp.V16等需要重新修订［18］.
杜洛埃藻属物种最早从美国的土壤中分离得到［15］，最近在韩国［16］和俄罗斯［17］发现该属的其他新种，但目前该属物种在我国还未见报道和描述.本文首次报道了采自我国西藏自治区的淡绿杜洛埃藻，通过形态特征、生态学和系统发育学结合的多相方法对其进行分类鉴定.新记录种的报道增加了中国蓝藻物种多样性，为保护和研究藻种种质资源提供基础.
1 材料与方法
1.1 样品采集
2023年7月，在中国西藏自治区拉萨市柳东大桥旁（29°35′57″N，91°20′54″E）使用小刀和镊子采集藻种，将采集到的样品装入收集瓶中，一份用福尔马林固定保存，一份用于藻株分离纯化与培养，采集地环境因子如下：海拔为3 620 m，温度为16.2 ℃，pH值为8.41.
1.2 藻株分离纯化与培养
将采集的样品进行富集培养，在显微镜下采用经典的毛细管分离法［19］分离纯化藻株，首先在倒置显微镜下挑取单根藻丝体，ddH2O清洗多次，最后放入含有2 mL BG11培养基的24孔细胞培养板中培养，4～5周便可得到单克隆藻种.镜检若为纯培养藻种，可转入250 mL三角瓶中扩大培养，放置在恒温光照培养箱中，保持光照强度2 000 lx，温度（25±1） ℃，光周期12 h∶12 h［20］，纯化后的藻种保藏于太原师范学院淡水藻种库中，藻株编号为SXACC0052.
1.3 形态特征
野外采集到的样品及实验室纯化后的藻株使用Nikon Eclipse NI型光学显微镜［21］观察其形态特征，藻种的显微图片使用外接电脑的NIS-Elements D 5.20软件进行拍摄，同时测量藻丝及顶端细胞的尺寸，尺寸由“min-average-max”表示，每个样本至少包含35个藻丝体.拍摄的照片使用软件Adobe Illustrator CS5和Adobe Photoshop CC 2019 SP 20.0.0进行处理.
1.4 分子生物学分析
1.4.1 DNA提取、PCR扩增及序列测定
使用CTAB法［22］提取藻株的DNA，将提取到的DNA放入-20 ℃的冰箱中保存备用.选取16S rRNA基因和16S-23S rRNA ITS序列进行系统发育分析，用于扩增16S rRNA基因序列的引物为F1［23］（5′-TTGATCCTGGCTCAGGATGA-3′）和1 492［24］（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），用于扩增16S-23S ITS 区域的引物为322（5′-CTCTGTGTGCCTAGGTATCC-3′）和340［25］（5′-GGGGAATTTTCCGCAATGGG-3′）.
PCR反应体系：2 μL 基因组 DNA、正反引物各3 μL（10 μmol/L），0.5 μL Taq DNA聚合酶（83.35 nkat/μL）、4 μL dNTP混合液（2.5 mmol/L）、5 μL 10 ×Easy Taq Buffer和32.5 μL ddH2O.PCR扩增程序为：95 ℃下预变性3 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，这个阶段进行35次循环［7］，最后，在72 ℃下延伸5 min.用质量分数1%琼脂糖凝胶电泳法检验PCR产物，以确保获得预期扩增的序列.将纯化的PCR产物进行双向测序，测序由北京华大基因公司完成.测序后的序列提交到 NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）GenBank数据库中，登录号为PP413587和PP413588.
1.4.2 构建系统发育树
将测序获得的序列与NCBI数据库中的序列进行比对，选取并下载相似度较高和有代表性的序列进行系统发育树的构建.为了确定分离的藻株的归属和系统发育位置，使用软件Bio Edit 7.0中的Clustal W对序列进行多重比对分析［26-27］，然后编辑序列，切除未对齐的两端序列并用目视检查，将对齐的序列利用软件MEGA 11［28］采用邻接法（NJ）和最大简约法（MP）构建系统发育树，使用软件RAxML Version 8［29］构建最大似然（ML）系统发育树，最适模型是由MEGA 11中Find Best DNA/Protein Models程序对相关序列进行测试，在 Model Finder 的 Akaike 信息准则（AIC）下［30］，最佳拟合模型为 GTR＋G，通过使用 1 000 次重复的引导分析来估计系统发育树的稳健性［31］.利用Mrbayes 3.1.2［32］进行贝叶斯分析，运行1 000 000代，每100代取样，去除前25%样本树，剩余样本构建系统树，分枝支持率用贝叶斯后验概率表示，使用软件Fig Tree version 1.4.2［33］对贝叶斯树进行编辑处理.以Gloeobacter violaceus PCC7421作为一个外类群，构建的系统发育树使用软件Adobe Illustrator CS5进行处理.
1.4.3 ITS二级结构预测
16S-23S rRNA序列比对后剪切对齐，使用软件RNA structure 5.7［34］预测藻株的二级结构，分析并对比藻株的D1-D1′、Box-B以及V3螺旋结构，进一步对该藻株进行分类鉴定.所有藻株的结构格式都在Adobe Illustrator CS5中进行修改.
2 结 果
2.1 形态描述
藻株橄榄绿色或蓝绿色，多数藻丝单生，有时缠绕在一起（图1）.丝状体直或稍微弯曲，直径约为（1.9/2.2/2.5） μm（最小值/均值/最大值）.鞘坚硬，清晰且薄，偶尔加宽（图1蓝色箭头）.藻丝由圆柱形的细胞组成，细胞大多等径，在分裂的藻丝中变得长大于宽，细胞宽（1.8/2.1/2.4） μm，长（1.4/2.1/2.8） μm，在横壁处不收缩或略微收缩.末端细胞圆形，没有观察到假分支，无藻殖段，没有帽状体，存在死细胞（图1红色箭头），通过藻丝断裂而繁殖（表1）.
参考藻株：Drouetiella lurida SXACC0052.
分布：中国西藏自治区拉萨市柳东大桥旁.
生境：潮湿土壤.
2.2 系统发育分析
测序得到藻株SXACC0052的16S rRNA 基因序列长度为1 308 bp，其与杜洛埃藻属藻株的16S rRNA序列相似度为95.76%～99.25%，与淡绿杜洛埃藻的16S rRNA基因序列相似度＞99%（表2）.选择与藻株SXACC0052相似度较高的序列，以Gloeobacter violaceus PCC7421为外类群，采用ML、NJ和BI法构建包括56个蓝藻类群的系统发育树，3种方法具有较为一致的分支位点的拓扑结构，文中展示了采用ML法构建的系统发育树，在图中分支节点处标出了ML/NJ/BI的步展支持值和后验概率（图2）.16S rRNA 基因系统发育树主要包括10个属，培养和测序的这株丝状蓝藻SXACC0052分布在杜洛埃藻属的进化枝中（图2红色进化枝），并且与淡绿杜洛埃藻聚为一支（图2红色字体），具有较高的步展支持值和后验概率，为98/78/1，与杜洛埃藻属中的其他物种分离.
藻株SXACC0052的16S-23S rRNA序列长度为658 bp，与杜洛埃藻物种的16S-23S rRNA序列相似度较高，其中与Drouetiella lurida Lukesova 1986/6的相似度最高（表3）.选择藻株SXACC0052与杜洛埃藻属内有代表性的序列，以Oculatella castenholzii YNP74-MA2为外类群，采用NJ/ML/MP法基于16S-23S ITS区间构建系统发育树，3种方法具有较为一致的分支位点的拓扑结构，文中展示了采用NJ法构建的系统发育树，在图中分支节点处标出了NJ/ML/MP的步展支持值（图3）.系统发育树包括15个蓝藻类群，藻株SXACC0052分布在淡绿杜洛埃藻进化枝中，与Drouetiella lurida KPABG 4163和Drouetiella lurida Lukesova 1986/6聚为一支（图3蓝色字体），NJ/ML/MP的步展支持值为85/99/89，与杜洛埃藻属中的其他物种分离.
2.3 16S-23S rRNA ITS二级结构分析
藻株SXACC0052的16S-23S rRNA序列长度为825 bp，选择D1-D1′螺旋、Box-B螺旋和V3螺旋这3个保守区域进行研究.SXACC0052与淡绿杜洛埃藻的D1-D1′螺旋结构大致相同，但有些碱基具有差异（图4），SXACC0052的D1-D1′螺旋含有64个核苷酸（图4（a）），共有5个茎环结构，基部茎由5个bp的螺旋构成，基部3′侧环由7个未配对的核苷酸组成（5′-CAUCCCA-3′），之后是1个1∶1的双侧凸起（U∶U），在位置14-17/41-44和23-24/34-35处具有内环，末端环包含3 bp碱基（5 ′-UAC-3 ′）.与Drouetiella lurida Lukesova 1986/6的结构相同，只有第10位和第30位的碱基不同（图4）.杜洛埃藻物种的Box-B结构高度相似（图5），SXACC0052与淡绿杜洛埃藻的Box-B结构相同（图5（a）），Box-B螺旋33个核苷酸长，共有3个茎环结构，基部茎由4个bp的螺旋构成，与淡绿杜洛埃藻相比，SXACC0052的末端环碱基不同（图5），末端环包含5 bp碱基（5′-GGAAG-3′）.SXACC0052的V3螺旋结构包括52个核苷酸，有3个茎环结构，基部茎由4个bp的螺旋构成，末端环包含4 bp碱基（5′-UUAG-3′），与Drouetiella lurida ACKU669的V3螺旋结构相似（图6（e）），但该藻株碱基发生变化，第31位变为尿嘧啶，末端环碱基也不同（图6红色字体）.从图中可知，藻株SXACC0052属于淡绿杜洛埃藻（图4至图6）.
3 讨 论
目前，细点丝藻科包含21属63种，该科中各属下物种形态较为相似，仅依靠形态鉴定无法准确区分属以下物种.通过形态特征比较，杜洛埃藻属物种也表现出和其他物种难以区分的丝状体形态［17］，以及它们之间的细胞大小的变异性，因此运用形态学、生态学和分子数据等多相分析方法来进行系统发育分析逐渐成为确定蓝藻正确分类地位的最佳方法.MAI［15］在2018年从细鞘丝藻科（Leptolyngbyaceae）中划分出了细点丝藻科，同时描述了新属杜洛埃藻属和该属中的3个新种，分别是Drouetiella lurida、Drouetiella hepatica和Drouetiella fasciculata.在最初的描述中，模式种淡绿杜洛埃藻的特征是红棕色的藻丝［15］.之后，KIM等［16］从韩国发现橄榄绿色的淡绿杜洛埃藻，该种的特征是偶尔出现假分枝，横壁收缩或不收缩，同时也描述了该属的新种Drouetiella epilithica，它的藻丝呈现亮蓝绿色，不存在假分枝.DAVYDOV等［17］在俄罗斯也发现该属的踪迹，将其描述为新种Drouetiella ramosa.系统发育分析表明，杜洛埃藻属进化枝中存在未定种序列Drouetiella sp.，还有存在细鞘丝藻科（Leptolyngbyaceae）中的某些属，所以该属仍需要进行系统的修订［18］.根据藻类数据库Algaebase统计，目前杜洛埃藻属有5个物种被有效描述且接受［35］，该属的大部分物种都为陆生种类，并且该属还存在一定的形态可塑性，预计这一特殊的丝状蓝藻类群在未来得到更多的关注和报道.
从我国西藏分离到的丝状蓝藻SXACC0052与杜洛埃藻属种的形态特征相似，藻丝橄榄绿色，有无色且坚固的鞘，横壁不收缩或稍微收缩，细胞大小相似，与MAI［15］描述的模式种淡绿杜洛埃藻的藻丝颜色不同，并且存在死细胞，这可能是由于不同生境分离的藻株具有微小差异.通过16S rRNA基因构建系统发育树，发现SXACC0052分布在杜洛埃藻属进化枝中，并且与淡绿杜洛埃藻聚为一支，具有较高支持值（图2红色进化枝）.与淡绿杜洛埃藻内的几个序列的相似度大于99%（表2），高于2014年KIM等［36］建议的区分2个物种的阈值.运用杜洛埃藻属物种的ITS序列构建系统树，发现SXACC0052分布在淡绿杜洛埃藻进化枝中，并且与Drouetiella lurida KPABG4163和Drouetiella lurida Lukesova 1986/6聚为一支.同时预测SXACC0052的二级结构，发现它的D1-D1′螺旋、Box-B螺旋和V3螺旋这3个保守区域都与淡绿杜洛埃藻具有较高的相似度，进一步证实了形态学和系统发育分析的鉴定结果.因此，藻株SXACC0052为中国的一个新记录种淡绿杜洛埃藻.
淡绿杜洛埃藻在我国属于首次报道，增加了我国蓝藻的物种多样性.目前，有关杜洛埃藻属的研究报道较少，现主要分布在美国［15］、韩国［16］和俄罗斯［17］等国家.本研究可以更完整地描述杜洛埃藻属的特征，其生态学的研究仍需要更多的藻株来证实.未来期待更多的丝状蓝藻被发现、分离和鉴定，利用更加先进的分子生物学方法探索我国蓝藻的多样性.
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Drouetiella lurida： a new record species of cyanobacteria isolated from Xizang， China
Wang Jie1a，b， Zhang Ting1a， Cai Fangfang2， Dong Jianxin1a， Li Yanhui1a，b， Liu Qi3
（1. a. College of Biological Science and Technology; b. Shanxi Key Laboratory of Earth Surface Processes and Resource
Ecology Security in Fenhe River Basin， Taiyuan Normal University， Jinzhong" 030619， China; 2. School of
Animal Science and Nutritional Engineering， Wuhan Polytechnic University， Wuhan" 430023， China;
3. College of Life Science， Shanxi University， Taiyuan" 030006， China）
Abstract： Species in the genus Drouetiella Mai， Johansen amp; Pietrasiak are morphologically plastic， easily confused with other species in the family of Oculatellaceae， in which strains are isolated from terrestrial communities and characterized using a polyphasic approach that includes molecular， morphological and ecological information. A filamentous cyanobacteria was isolated from the moist soil of Lhasa， Xizang Autonomous Region， China， named SXACC0052. The morphology of isolated strain was similar to Drouetiella lurida（（Gomont）Mai， Johansen amp; Pietrasiak）， the trichomes were olive-green， with colorless and firm sheaths， the cross-walls were not constricted or slightly contracted， no 1-branching was observed. The comparative analysis of 16S rRNA gene and 16S-23S rRNA ITS sequences showed that the strain shared high similarities with Drouetiella lurida and clustered into a single branch in the phylogenetic tree with bootstrap value of 98/78/1 and 85/99/0.89， respectively. In addition， the ITS secondary structure of this filamentous cyanobacteria has a high similarity to that of Drouetiella lurida， which further indicated that this filamentous cyanobacteria belonged to Drouetiella lurida. Drouetiella is a new record genus reported for the first time in China， Drouetiella lurida is a new record species reported for the first time in China. The discovery of this species enriches the species diversity of cyanobacteria in China and provides a theoretical basis for the conservation and continuous understanding of algae resources.
Keywords： Drouetiella lurida; Xizang; cyanobacteria; new record; phylogeny
［责任编校 刘洋 赵晓华］
