二斑叶螨对阿维菌素不同抗性水平与解毒酶的关系分析

摘""要：二斑叶螨是世界危险性有害生物。阿维菌素是二斑叶螨防治中使用最为广泛的杀螨剂之一，其不合理施用导致的抗药性问题日益严重。探究二斑叶螨对阿维菌素的抗性机理，可为延长药剂的使用寿命及制定综合防控策略提供理论依据。为此，本研究首先开展了阿维菌素对二斑叶螨田间种群、实验室筛选的抗性种群、敏感种群的生物测定，发现3个种群的24"h致死中浓度（LC50）分别为7.19、2061.43、0.10"mg/mL，"48"h的LC50分别为6.32、1971.55、0.09"mg/mL。以敏感种群的LC50为基准，田间种群和实验室抗性种群的抗性倍数超过70倍和20"000倍，分别属于中等水平抗性和高水平抗性。对LC50处理下存活二斑叶螨的解毒酶活性分析表明，抗性种群的谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）和尿苷二磷酸糖基转移酶（UGTs）的活性最高，田间种群次之，并均显著高于敏感种群的酶活性，与用药前相比，用药处理后高抗种群和田间中抗种群的酶活性均随着处理时间的延长而提高，而敏感种群的酶活性显著被抑制。采用荧光定量PCR比较上述解毒酶的编码基因表达量差异，发现用药处理后，GSTm09、GSTd10和UGT204a2、UGT201d3基因在高抗种群和田间中抗种群的表达量显著高于敏感种群，并随着处理时间的延长，抗性种群和敏感种群的解毒酶基因表达的差异倍数进一步增大。相关性分析表明，解毒酶活性及其编码基因表达与阿维菌素的抗性水平呈显著正相关。本研究结果为深入挖掘二斑叶螨抗性靶标基因和研发抗性治理策略提供理论参考。

关键词：二斑叶螨；阿维菌素；抗药性；解毒酶；相关性分析中图分类号：S433.1""""""文献标志码：A

Analysis"of"the"Relationship"Between"Abamectin"Resistance"Levels"and"Detoxification"Enzymes"of"Tetranychus"urticae

HAO"Guifeng1，2，3，"LIU"Ying2，3，"WU"Chunling2，3，"AN"Xingkui2，3，"CHEN"Qing2，3*，"LIANG"Xiao2，3*

1."School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Haikou，"Hainan"570228，"China;"2."Environment"and"Plant"Protection"Institute，"China"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Integrated"Pest"Management"on"Tropical"Crops，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs"/"Hainan"Engineering"Research"Center"for"Biological"Control"of"Tropical"Crops"Diseases"and"Insect"Pests，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"3."Sanya"Research"Academy，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agriculture"Science"/"Hainan"Key"Laboratory"for"Biosafety"Monitoring"and"Molecular"Breeding"in"Off-Season"Reproduction"Regions，"Sanya，"Hainan"572000，"China

Abstract："Tetranychus"urticae"is"a"dangerous"agricultural"pest"worldwide."Abamectin"is"a"widely"used"acaricide"in"the"prevention"and"control"of"T."urticae."However，"the"resistance"caused"by"inappropriate"application"of"acaricide"has"become"an"increasing"challenge."Explorating"the"resistant"mechanisms"of"T."urticae"against"abamectin"can"provide"the"theoretical"basis"for"prolonging"lifespan"and"perform"a"comprehensive"prevention"and"control"strategy."In"this"study，"we"conducted"an"abamectin"bioassays"on"field"population，"laboratory-derived"resistant-and"sensitive"populations."It"was"found"that"the"24"h"median"lethal"concentration"（LC50）"values"of"the"three"populations"was"7.19"µg/mL，"2061.43"µg/mL"and"0.10"µg/mL，"respectively，"while"the"LC50"values"of"the"48"h"was"6.32"µg/mL，"1971.55"µg/mL"and"0.09"µg/mL，"respectively."In"addition，"the"resistance"ratio"of"the"field"population"and"the"laboratory"resistant"population"exceeded"70-fold"and"20"000-fold"respectively，"which"belonged"to"the"medium"resistance"level"and"the"high"resistance"level."Detoxification"enzyme"activity"of"surviving"T."urticae"following"exposure"to"LC50"treatment"showed"that"the"activity"of"glutathione"S-transferase"（GSTs）"and"uridine"diphosphate"glycosyltransferase"（UGTs）"in"the"resistant"population"was"the"highest，"followed"by"the"field"populations，"and"both"two"population"were"significantly"higher"than"those"of"sensitive"population."In"comparison，"prior"to"the"acaricide"treatment，"the"enzyme"activity"of"the"highly"resistant"population"and"the"medium"resistant"population"increased"over"time，"while"the"enzyme"activity"of"the"sensitive"population"were"inhibited."Quantitative"PCR"was"used"to"compare"the"expression"differences"of"the"coding"gene"of"the"above"enzyme"detoxification"enzymes."It"revealed"that"prior"to"the"treatment，"the"expression"level"of"GSTm09，"GSTd10，"UGT204a2"and"UGT201d3"in"the"highly"resistant"population"and"the"medium"resistant"population"in"the"field"was"significantly"higher"than"that"in"the"sensitive"population，"and"the"difference"in"the"expression"of"detoxification"enzyme"genes"between"the"resistant"population"and"the"sensitive"population"increased"further"with"the"extension"of"treatment"time."Correlation"analysis"showed"that"the"detoxification"enzyme"activity"and"the"expression"of"the"coding"genes"were"significantly"positively"correlated"with"the"resistance"level"to"abamectin."The"study"would"provide"a"theoretical"reference"for"in-depth"exploration"of"T."urticae"resistant"target"genes"and"the"development"of"resistance"management"strategies.

Keywords："Tetranychus"urticae;"abamectin;"resistance;"detoxification"enzyme;"correlation"analysis

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.02.014

二斑叶螨（Tetranychus"urticae"Koch）是全球性的植食性害螨[1]，其寄主植物超过1100多种，该螨主要集中在叶背刺吸汁液为害，导致叶片黄化甚至大面积脱落，造成的为害损失十分严重[2]。当前二斑叶螨的防控仍依赖化学药剂，但高频次、不合理使用农药所致的害螨抗药性问题突出，严重制约了二斑叶螨的高效绿色防控[3]。

阿维菌素是大环内酯类杀螨剂[4]，通过刺激害螨释放神经递质γ-氨基丁酸，致使神经系统过度刺激，从而引起麻痹和死亡。该药剂对人畜及非靶标生物安全，在农田环境中易降解，自投入市场以来便迅速成为防治二斑叶螨的主流药剂之一。与其他杀螨剂相似，二斑叶螨对阿维菌素的抗药性问题也日益突出。在我国及全球其他频繁使用阿维菌素进行二斑叶螨防治的区域，均有产生不同抗性水平的田间害螨种群的相关报道[5-7]。

二斑叶螨对阿维菌素抗性机制的研究已超过20"a的历史。抗性基因的点突变[8]，解毒酶活性的提高[9]及抗性基因的表达量变化[10]等均被证实与二斑叶螨对阿维菌素的抗性形成机制有关，其中解毒酶介导的抗性机制研究较为广泛。许多研究表明，细胞色素P450酶（CYP450s）[11]、谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）[12-13]、尿苷二磷酸糖基转移酶（UGTs）[14-16]等活性的显著提高及其编码基因的过表达对抗性形成的贡献度较大。然而，二斑叶螨解毒酶的表达水平是否与其抗性水平相关研究较少。

为明确二斑叶螨不同阿维菌素抗性水平与解毒酶的相关性，本研究首先开展了阿维菌素对不同抗性水平的3个二斑叶螨种群的生物测定，明确阿维菌素对不同种群的活性，进一步采用致死中浓度处理后，比较不同种群二斑叶螨GSTs、UGTs酶活性和相关编码基因的表达量变化，阐明抗性水平与解毒酶表达的相关性，为二斑叶螨的抗性治理提供科学依据。

1""材料与方法

1.1""材料

1.1.1""供试二斑叶螨""阿维菌素敏感种群（S）和抗性种群（R）为实验室筛选种群，由西南大学植物保护学院何林教授团队馈赠；田间种群（F）采集自海南省儋州市国家木薯种质资源圃。3个二斑叶螨种群的实验室饲养条件为：温度（26±"1）"℃，相对湿度（70±5）%，光周期14"L/10"D[17]。

1.1.2""供试药剂""95%阿维菌素原药购自山东金龙农资有限公司。

1.2""方法

1.2.1""二斑叶螨室内毒力测定及抗性水平分析""配制阿维菌素原药系列浓度用于二斑叶螨敏感种群（1.00、0.75、0.50、0.15、0.05"mg/mL）、抗性种群（3500、3000、2500、2000、1500"mg/mL），田间种群（80、40、20、10、5"mg/mL）的室内毒力测定。药剂配制溶液及对照均为4%二甲基甲酰胺水溶液[含0.1%"（V/V）"Tween-80]。采用实验室前期建立的叶片浸渍法进行毒力测定[18]，将供试药剂小心倾倒在接有30头二斑叶螨雌成螨的豇豆叶片上，让叶片充分浸渍在药液中10"s，然后用镊子小心夹起叶片，沥干药液，将其置于（26±"1）℃，相对湿度（70±5）%，光周期14"L/10"D的光照生化培养箱中，分别在24、48"h后检查死亡情况。用0号毛笔轻轻拨动螨体，若其足不动则判定为死亡[19-20]。每个浓度及对照需处理30头二斑叶螨，3个生物学重复。死亡率=（死亡螨数/供试螨数）×100%；校正死亡率=[（处理组死亡率–对照组死亡率）/（1–对照组死亡率）]×100%。计算3个种群害螨的致死中浓度（LC50），以敏感种群的LC50为基准，分别计算抗性种群和田间种群LC50与敏感种群LC50的比值，即抗性倍数（resistance"ratio，"RR）。抗性水平划分标准：RR≤5.0为敏感状态，5.0lt;RR≤10.0为低水平抗性，10.0lt;RR≤100.0为中等水平抗性，RRgt;100.0为高水平抗性。

1.2.2""二斑叶螨解毒酶活性测定""以敏感、抗性、田间3个二斑叶螨种群的阿维菌素LC50进行处理，方法同毒力测定，分别于药剂处理前（0"h），处理24"h和48"h后收集存活的二斑叶螨进行UGTs、GSTs酶活分析，每个时间点设置3个重复，每重复50头二斑叶螨。采用1"mL"PBS缓冲液（0.01"mol/L，pH"7.4），用电动匀浆器研磨二斑叶螨样品，并于4"℃，7500"r/min离心5"min，转移上清至新的1.5"mL离心管中，于–20"℃保存待用。酶活性测定参照上海酶联公司的UGTs、GSTs酶活试剂盒的方法进行。

1.2.3""二斑叶螨解毒酶基因表达量分析""二斑叶螨的药剂处理方法参见1.2.2。选择已报道的与阿维菌素抗性相关的二斑叶螨GSTs基因（TuGSTm09、TuGSTd10）或其近似种朱砂叶螨的UGTs基因（UGT204a2、UGT201d3）（表1），分析阿维菌素以LC50处理前后对害螨基因表达水平的影响。RNA提取参照范东哲等[21]的昆虫组织TRIzol提取法，利用琼脂糖凝胶电泳、超微量紫外分光光度计（Thermo）检测其浓度纯度和完整性。取1.0"mg去除gDNA的RNA进行cDNA第一条链的合成，参照ToloScript"ALL-in-one"RT"EasyMix"for"qPCR（TOLOBIO，中国）。

cDNA样品经RNase-free"ddH2O稀释5倍后作为qPCR的模板，以二斑叶螨Actin作为内参基因（表1）。qPCR反应体系的配制参照2×Q3"SYBR"qPCR"Master"Mix试剂盒（TOLOBIO，中国）。qPCR反应条件为：95"℃预变性30"s；95"℃变性10"s，60"℃下退火30"s，72"℃延伸20"s"，40次循环，使用LightCycler®96仪器（Roche，瑞士）程序采集扩增曲线和溶解曲线。以相同时间内敏感种群基因的表达量归一化设置为1.0，阿维菌素处理后抗性种群、田间种群基因的表达量以敏感种群的相对倍数表示，采用2–ΔΔCT方法[22]进行qPCR结果分析，每个处理均设置3个生物学重复，每个生物学重复设置3个技术重复。

1.3""数据处理

利用Excel软件进行数据汇总与分析，采用PoloPlus软件计算二斑叶螨敏感种群、田间种群和抗性种群的毒力回归方程、LC50以及其95%置信限等相关毒力参数指标；使用统计学软件DPS（V9.50）的Turkeyʼs多重比较法分析不同种群在阿维菌素处理前后的解毒代谢酶活性及其编码基因的表达量差异。采用Spearman法分别分析二斑叶螨酶活及基因表达与对其抗性水平的相关性。

2""结果与分析

2.1""阿维菌素对不同种群二斑叶螨的毒力测定及抗性水平分析

表2结果表明，阿维菌素对不同二斑叶螨种群的毒力水平差异较大。室内筛选的敏感种群、抗性种群以及田间种群24、48"h的LC50分别为0.10、0.09"mg/mL，2061.43、1971.55"mg/mL和7.19、6.32"mg/mL。以敏感种群为基准，计算田间种群和抗性种群的抗性倍数，结果表明，田间种群的抗性倍数约为70倍，属于中等水平抗性，抗性种群的抗性倍数超过20"000倍，属于高水平抗性。

2.2""阿维菌素处理后不同抗性水平二斑叶螨UGTs酶活性差异分析

阿维菌素处理前后，不同抗性水平二斑叶螨的UGTs活性存在显著差异。用药处理前，抗性种群的UGTs酶活性显著高于田间种群，并且这二者的酶活性也显著高于敏感种群。此外，用药处理24"h和48"h后，抗性种群和田间种群的UGTs酶活性较用药前显著提高1.58、1.42倍和1.29、1.20倍，并且仍然表现出抗性种群UGTs酶活显著高于田间种群的趋势。与之相反，敏感种群用药处理24"h和48"h后，其UGTs酶活降低至用药前的20.14%和33.43%（图1）。

2.3""阿维菌素处理后不同抗性水平二斑叶螨GSTs酶活性差异分析

阿维菌素处理前后，不同抗性水平二斑叶螨的GSTs活性存在显著差异（图2）。用药处理前，抗性种群的GSTs酶活性显著高于田间种群，并且这二者的GSTs酶活也显著高于敏感种群。此外，用药处理24"h和48"h后，抗性种群和田间种群的GSTs酶活性较用药前显著提高1.61、1.56倍和1.29、1.20倍，并且仍表现出抗性种群GSTs酶活显著高于田间种群的趋势。与之相反，敏感种群用药处理24"h和48"h后，其GSTs酶活性降低至用药前的20.89%和32.63%。

2.4""阿维菌素处理后不同二斑叶螨种群解毒基因UGT204a2表达量差异分析

阿维菌素处理前后，不同抗性水平二斑叶螨UGT204a2表达量存在显著差异（图3）。用药处理前，田间种群的UGT204a2表达量略高于敏感种群和抗性种群，分别为后二者的1.28倍和2.01倍。用药处理24"h和48"h后，田间种群和抗性种群的UGT204a2基因表达量显著高于敏感种群，前二者分别达到后者的2.35、3.04倍和6.62、9.69倍（Plt;0.05），表明阿维菌素处理后，UGT204a2在阿维菌素中抗、高抗的二斑叶螨种群中的表达量显著高于敏感种群。

2.5""阿维菌素处理后不同种群UGT201d3解毒代谢基因的表达差异分析

阿维菌素处理前后，不同抗性水平二斑叶螨UGT201d3表达量存在显著差异（图4）。用药处理前，田间种群的UGT201d3表达量略高于敏感种群和抗性种群，分别为后二者的1.40倍和1.63倍。用药处理24"h和48"h后，田间种群和抗性种群的UGT201d3基因表达量显著高于敏感种群，前二者分别达到后者的3.35、4.20倍和3.53、4.54倍（Plt;0.05），表明阿维菌素处理后，UGT201d3在阿维菌素中抗、高抗的二斑叶螨种群中的表达量显著高于敏感种群。

2.6""阿维菌素处理后不同种群TuGSTm09解毒代谢基因的表达差异分析

阿维菌素处理前后，不同抗性水平二斑叶螨TuGSTm09表达量存在显著差异（图5）。用药处理前，田间种群的TuGSTm09表达量略高于敏感种群和抗性种群，分别为后二者的2.57倍和2.72倍。用药处理24"h和48"h后，田间种群和抗性种群的TuGSTm09基因表达量显著高于敏感种群，前二者分别达到后者的2.61、5.58倍和5.62、9.37倍（Plt;0.05），表明阿维菌素处理后，TuGSTm09在阿维菌素中抗、高抗的二斑叶螨种群中的表达量显著高于敏感种群。

2.7""阿维菌素处理后不同种群TuGSTd10解毒代谢基因的表达差异分析

阿维菌素处理前后，不同抗性水平二斑叶螨TuGSTd10表达量存在显著差异（图6）。用药处理前，田间种群的TuGSTd10表达量略高于敏感种群和抗性种群，分别为后二者的1.81倍和7.30倍。用药处理24"h和48"h后，田间种群和抗性种群的TuGSTd10基因表达量显著高于敏感种群，前二者分别达到后者的2.89、6.74倍和4.93、16.30倍（Plt;0.05），表明阿维菌素处理后，TuGSTd10在阿维菌素中抗、高抗的二斑叶螨种群中的表达量显著高于敏感种群。

2.8""解毒酶基因表达与阿维菌素不同抗性水平的相关性分析

Spearman相关性分析结果表明，阿维菌素LC50进行处理时，存活二斑叶螨的UGTs、GSTs活性均与其抗性水平呈极显著正相关，相关系数分别为0.9094（P=0.0007）、0.9143（P=0.0006）；UGTs酶的编码基因UGT204a2、UGT201d3表达量与阿维菌素抗性水平呈正相关，相关系数分别为0.6848（P=0.1333）、0.9650（P=0.0018）；GSTs酶的编码基因TuGSTm09、TuGSTd10表达量与阿维菌素抗性水平呈显著正相关，相关系数分别为0.8844（P=0.0193）、0.8170（P=0.0472）（表3）。

3""讨论

不同用药水平下害虫害螨的抗药性水平差异显著。黄保宏等[24]研究发现，同种药剂对不同用药水平地区的黑缘红瓢虫（Chilocorus"rubidus）成虫的毒力差异显著，其中氰戊菊酯和氟氯氰菊酯用药水平较低的种群的敏感性显著高于用药水平较高地区的种群。PU等[25]分析发现田间采集的小菜蛾（Plutella"xylostella）种群对阿维菌素产生了超过5000倍的抗性，将该种群用阿维菌素进行21代的连续抗性筛选后抗性倍数进一步增强到23"670倍。刘贻聪等[26]研究表明二斑叶螨北京密云种群（MY-BJ）、山东潍坊种群（WF-SD）、海南三亚种群（SY-HN）、湖南长沙种群（CS-HN）对阿维菌素产生了极高水平的抗性，与敏感种群（SS）相比，MY-BJ种群对阿维菌素的抗性达1526.75倍，WF-SD种群对阿维菌素的抗性达481.00倍，SY-HN种群对阿维菌素的抗性达315.25倍，CS-HN种群对阿维菌素的抗性达160.75倍，推测抗性水平的差异可能与不同地区的用药水平及寄主种类有关。在阿维菌素对二斑叶螨的室内抗性筛选中，随着筛选轮次（用药次数）的增加，其抗性水平也呈现显著升高的趋势。例如，李瑞娟等[27]研究发现阿维菌素对二斑叶螨敏感进行9轮的抗性筛选后，其抗性水平提高了5.8倍。在周兴隆[28]的研究中，经过连续59代的抗性筛选后，二斑叶螨对阿维菌素的抗性水平提高了658.44倍。此外，随着田间用药水平的下降以及中断对室内抗性种群的药剂筛选时，害虫对药剂的抗性水平也表现出逐渐降低的趋势[29-31]。本研究采用的二斑叶螨抗性种群经过了超过100代的抗性筛选，对阿维菌素产生了极高水平的抗性，采集的田间种群寄主来源为木薯，而在国内外实际生产中，木薯上阿维菌素及其他对害螨具有潜在交互抗性的杀螨剂的用药水平较低，抗性代价较小，因此田间种群为中抗水平。

害螨对阿维菌素的抗性与解毒酶活性的显著升高有关。ÇAĞATAY等[32]鉴定发现菜豆和黄瓜上采集的二斑叶螨田间种群对阿维菌素分别产生了223、404倍的抗性，细胞色素P450酶、GSTs、羧酸酯酶的活性相较敏感种群显著提高了1.39～3.51倍，推测这些酶活的升高与其抗性形成有关。赵卫东等[33]研究指出，对阿维菌素产生抗性的田间二斑叶螨种群体内多功能氧化酶和GSTs活性与敏感种群相比均有所增加。高萍等[34]通过比较对阿维菌素敏感的二斑叶螨种群和抗性种群的乙酰胆碱酯酶和GSTs活性发现，抗性种群中这2个酶活性的升高导致其对阿维菌素的敏感性显著降低。此外，UGTs的活性升高也被证实与多种害螨，例如二斑叶螨[6]、朱砂叶螨（Tetranychus"cinnabarinus）[14]、柑桔全爪螨（Panonychus"citri）[35]对阿维菌素的抗性有关。本研究也发现UGTs和GSTs酶活性与二斑叶螨对阿维菌素的抗性水平呈显著正相关，并且在阿维菌素处理前，中抗的田间种群和高抗的实验室抗性种群的酶活性均显著高于敏感种群，而药剂处理后，这2个酶活性在2个二斑叶螨抗性种群中进一步提高，而敏感种群中上述酶活显著降低，表明抗性二斑叶螨能够激活体内的解毒系统对阿维菌素进行代谢，而敏感种群因缺乏有效的解毒能力而致毒。

害螨对阿维菌素的抗性与解毒酶编码基因表达量的显著上调有关。针对抗性种群二斑叶螨中解毒酶编码基因的研究发现，P450[24]以及GST[13]的基因过表达导致二斑叶螨对阿维菌素的抗性升高。编码UGT酶UGT201D3基因在抗阿维菌素朱砂叶螨中显著上调表达，将该基因通过体外表达后，发现该酶蛋白能够体外代谢阿维菌素，证实UGT201D3与阿维菌素抗性形成相关[14]。RIGA等[23]发现二斑叶螨P450s基因CYP392A16在抗性品系中显著过表达，同时该基因编码的P450酶能够代谢阿维菌素，直接证实CYP392A16参与阿维菌素的抗性形成。杨顺义[36]研究也发现，在二斑叶螨抗阿维菌素品系中，CYP392E7、TuGSTd16和TuCCE35基因相对表达量与敏感品系相比分别显著上调2.18、1.12、1.59倍，表明这些基因在转录水平的显著上调可能与阿维菌素的抗性形成有关。LIAO等[37]在抗阿维菌素的柑橘全爪螨种群中鉴定到一个显著上调表达的GST酶编码基因GSTm5，将此基因沉默后能显著增加害螨对阿维菌素的敏感性。本研究中对阿维菌素中抗的田间种群的相关解毒酶基因如UGT204a2、UGT201d3、TuGSTm09、TuGSTd10表现出了最高的组成型表达水平，并且敏感种群中上述解毒酶基因的组成型表达与高抗种群持平甚至更高，表现出解毒酶的转录水平和蛋白水平不一致的情况，但药剂处理后，2个二斑叶螨抗性种群的基因表达均显著高于敏感种群，并且基因表达水平与抗性水平也呈显著正相关，说明抗性种群具有更强的诱导解毒酶活性的潜力。

本研究结果初步证实了解毒酶UGTs和GSTs活性及其编码基因UGT204a2、UGT201d3、TuGSTm09、TuGSTd10表达量与二斑叶螨对阿维菌素的抗性水平呈显著正相关，为深入挖掘二斑叶螨抗性靶标基因和研发抗性治理策略提供理论参考。

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