非洲猪瘟病毒p30蛋白氨基酸序列分段表达及反应原性分析

收稿日期：2023-12-11

基金项目：国家重点研发计划项目（2022YFD1800601）；国家自然科学基金项目（31941013）；江苏省农业科技自主创新基金项目[CX（21）3137）]；河北省省级科技计划资助项目（21322401D）；苏北科技专项（SZ-LYG202109）

作者简介：周俊明（1983-），男，江苏东台人，硕士，副研究员，主要从事动物传染病防治和诊断技术研究。（Tel） 025-84390988；（E-mail） zhoujm075@163.com

通讯作者：李 彬，（E-mail） libinana@126.com

摘要： 为比较非洲猪瘟病毒（African swine fever virus， ASFV）p30蛋白氨基酸序列中不同片段的反应原性，探究p30蛋白氨基酸序列中可能的抗原优势片段。本研究通过PCR、克隆技术将p30蛋白氨基酸序列中不同片段的编码基因分别插入表达质粒pET32a，经IPTG诱导、Ni柱纯化、透析后，获得p30蛋白氨基酸序列中8～101 aa片段（P-1#）、58～101 aa片段（P-2#）、101～158 aa片段（P-3#）、8～194 aa片段（P-4#），用酶联免疫吸附试验（ELISA）分析p30蛋白氨基酸序列中不同片段与p30蛋白免疫兔血清和ASFV阳性猪血清的反应原性。结果显示，上述片段均获得诱导表达及纯化，表达形式有可溶性表达（P-1#、P-3#）和包涵体表达（P-2#、P-4#）。各片段以1.0 mg/L包被时，p30免疫兔血清与p30蛋白氨基酸序列中4种片段均能发生免疫反应，ASFV阳性猪血清与P-4#、P-1#反应较佳，与P-3#反应中等，与P-2#反应最弱。综上，p30蛋白氨基酸序列中不同片段反应原性的差异为认识p30抗原优势区域提供了数据，这将有助于非洲猪瘟血清学诊断抗原的科学筛选。

关键词： 非洲猪瘟病毒；p30蛋白；氨基酸序列片段；反应原性

中图分类号： S852.65"" 文献标识码： A"" 文章编号： 1000-4440（2024）10-1875-07

Expression and reactogenicity analysis of the truncated amino acid sequence of p30 protein in African swine fever virus

ZHOU Junming， NI Yanxiu， FAN Baochao， ZHU Haodan， ZHU Xuejiao， WANG Dandan， HU Yiyi， LI Bin

（Institute of Veterinary Medicine， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Nanjing 210014， China）

Abstract： The purpose of this study was to compare the reactogenicity of different fragments of the p30 protein amino acid sequence of African swine fever virus （ASFV）， and to explore the possible antigen-dominant fragments in the p30 protein amino acid sequence. In this study， the coding genes of different fragments of p30 amino acid sequence were inserted into the expression plasmid pET32a by PCR and cloning techniques. After IPTG induction， Ni column purification and dialysis， 8-101 aa fragment （P-1#）， 58-101 aa fragment （P-2#）， 101-158 aa fragment （P-3#） and 8-194 aa fragment （P-4#） in the amino acid sequence of p30 protein were obtained. The reactogenicity of different fragments of p30 protein amino acid sequence with p30 protein immunized rabbit serum and ASFV positive pig serum was analyzed by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. The results showed that the above fragments were induced and purified. The expression forms were soluble expression （P-1#， P-3#） and inclusion body expression （P-2#， P-4#）. When each fragment was coated at 1.0 mg/L， the p30 immunized rabbit serum and the four fragments in the amino acid sequence of p30 protein could react with each other. The reaction of ASFV-positive pig serum with P-4# and P-1# was better， with P-3# was moderate， and with P-2# was the weakest. In summary， the differences in the reactogenicity of different fragments in the amino acid sequence of p30 protein provide data for understanding the dominant fragments of p30 antigen， which will help the scientific screening of serological diagnostic antigens of African swine fever.

Key words： African swine fever virus;p30 protein;amino acid sequence fragment;reactogenicity

非洲猪瘟（Afircan swine fever， ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的一种高度致死性传染病，可感染不同日龄和品种的家猪和野猪^[1]，临床表现急性出血热、皮肤斑点，剖检有淋巴结和内脏器官出血等症状^[2]。ASF被世界动物卫生组织（OIE）列为法定报告动物疫病，2018年8月，首次报道了非洲猪瘟病毒基因Ⅱ型毒株传入中国，在短短6个月内，高致死率的急性非洲猪瘟在中国大多数省份迅速传播，给中国养猪业造成了巨大损失^[3]；2020年报道非洲猪瘟病毒出现了低毒力基因Ⅱ型毒株^[4]；2021年出现非洲猪瘟基因Ⅰ型毒株，该毒株可引起猪慢性感染^[5]，上述低致病力毒株的出现给非洲猪瘟的防控带来新的挑战。

国际病毒分类委员会将ASFV归为非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，ASFV含有双层囊膜，基因组全长170～193 kb，包含151～167个基因^[6]，基因组中间区域较为保守，不同ASFV毒株之间的基因组差异主要来源于基因组末端多基因家族的不同^[7]。有研究利用原核表达系统表达了35种ASFV结构蛋白，并利用ASFV阳性猪血清评估这些蛋白的抗原性，结果显示，感染ASFV后p30蛋白诱发的免疫反应早且明显^[7]。p30定位于ASFV囊膜的内膜，由基因CP204L编码，主要参与了ASFV与靶细胞结合以及内化^[8-9]，目前已有较多研究利用p30单克隆抗体解析p30的抗原信息，以及表达p30全长蛋白建立ASFV抗体检测方法，但大部分原核表达获得的p30蛋白是以包涵体形式存在的。本研究拟开展p30蛋白氨基酸序列不同片段的原核表达，并分析p30蛋白不同区域的表达形式以及免疫反应特性，进一步丰富对p30抗原特性的认识。

1 材料与方法

1.1 载体、重组菌、蛋白和血清

p30重组表达质粒 pET28a-p30（1～194位氨基酸）、表达载体pET-32a（+）、硫氧还蛋白（TRX）、pET32a-p30（8～101位氨基酸）重组菌、pET28a-p30纯化重组蛋白均由江苏省农业科学院兽医研究所保存^[10]；非洲猪瘟阳性猪血清购自中国兽医药品监察所。

1.2 主要试剂

PrimeSTARMax DNA Polymerase、限制性核酸内切酶Bam HⅠ和SalⅠ、DNA Ligation Kit均购自宝日医生物技术（北京）有限公司；大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；羊抗兔IgG-HRP、硫酸卡那霉素溶液、10×PBS缓冲液、溶菌酶、Tween 20购自北京索莱宝科技有限公司；HisTrap HP预装柱购自Cytiva公司；HRP标记羊抗猪IgG（H+L）购自Bethyl公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；IPTG溶液、即用型氨苄青霉素钠溶液均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；预染蛋白Marker购自GeneDireX公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒均购自Omega公司。

1.3 兔p30多克隆抗体的制备

取适量纯化的pET28a-p30重组蛋白与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂分别进行乳化，蛋白质与佐剂体积比为1∶1，乳化后p30蛋白质量浓度为1 g/L。取3只体重3 kg的普通级新西兰兔（购自南京市青龙山动物繁殖场），分别皮下分点注射1 mL经弗氏完全佐剂乳化的p30蛋白，首次免疫后14 d和28 d，分别取经弗氏不完全佐剂乳化的p30蛋白，同上进行皮下免疫。首次免疫前7 d和末次免疫后7 d，分别采集兔血，分离出血清，分装后在-20 ℃条件下保存备用。

1.4 编码p30蛋白不同区域基因序列的克隆、转化

按重组质粒pET28a-p30中p30优化编码基因序列，设计系列引物，分别进行PCR扩增p30蛋白58～101位、101～158位、8～194位氨基酸序列的编码基因序列，扩增引物序列见表1；随后将各PCR扩增片段进行胶回收，利用限制性核酸内切酶Bam HⅠ和SalⅠ双酶切回收PCR片段，分别以连接酶连接表达载体pET-32a（+），连接产物分别转化入感受态BL21（DE3），经限制性核酸内切酶Bam HⅠ和SalⅠ双酶切鉴定阳性重组菌，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将实验室保存的pET32a-p30（8～101）重组菌以及新构建的表达p30蛋白不同氨基酸序列片段的重组菌pET32-p30（58～101）、pET32-p30（101～158）、pET32-p30（8～194）分别命名为1#、2#、3#、4#。

1.5 蛋白质表达及纯化

将4种重组菌进行体外扩大培养，按1%的比例接种至200 mL的LB液体培养基（含50 mg/L氨苄青霉素钠）中，37 ℃，220 r/min振荡培养至细菌液OD600值达到0.5左右时，加入终浓度1 mmol/L的IPTG，37 ℃，220 r/min继续振荡培养4 h，10 000 r/min离心收集菌体，加入10 mL 1×PBS重悬菌体，再加入终浓度为0.2 g/L的溶菌酶，混匀后冰上孵育30 min，以300 W，5 s超声，10 s间歇的条件，超声波破碎上述细菌混悬液，10 000 r/min离心15 min，分别收集上清液和沉淀，沉淀以变性缓冲液（8 mol/L尿素、20 mmol/L磷酸二氢钠、500 mmol/L氯化钠、20 mmol/L咪唑、pH 7.4）溶解，10 000 r/min离心15 min，收集上清液（包涵体蛋白）。收集诱导前菌体蛋白、诱导后菌体超声上清液、诱导后菌体超声沉淀样品各16 μL，加入4 μL 5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混匀，沸水浴10 min，处理后样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），分析不同重组蛋白的表达形式。收集PBS重悬的各诱导后的菌体，同上处理样品并进行免疫印迹试验（Western blot），分析各重组菌诱导蛋白质与His单抗的反应原性。随后参照HiTrap HP亲和层析柱说明书，纯化4种重组蛋白，以1×PBS作为缓冲液透析处理纯化蛋白质，随后NanoDrop分析蛋白质含量，调整含量后取适量重组蛋白进行SDS-PAGE分析。

1.6 ELISA

以包被液（100 mmol/L NaHCO3、46 mmol/L Na2CO3、pH 9.6）将各纯化的重组蛋白及硫氧还蛋白分别稀释至1.0 mg/L和0.1 mg/L，每孔100 μL，分别加入96微孔板中，4 ℃包被过夜；弃去抗原液，用PBST（1×PBS，含0.05% Tween 20）洗涤5次，每孔300 μL，每次10 s，加入PBST（含5%脱脂奶粉）封闭，每孔300 μL，37 ℃孵育2 h；弃去孵育液，同上洗涤，用PBST（含2%脱脂奶粉）分别稀释p30免疫兔血清或非洲猪瘟阳性猪血清（按体积比1∶40、1∶80、1∶160、1∶320稀释），同时设立40倍稀释的兔免疫p30前血清或ASFV抗体阴性猪血清分别作为阴性对照，每孔100 μL，加入96微孔板，37 ℃孵育30 min，弃去血清，同上洗涤，加入1∶10 000稀释的HRP标记羊抗兔二抗或HRP标记羊抗猪二抗，每孔100 μL，在37 ℃条件下作用30 min，弃去二抗，同上洗涤，每孔加入50 μL单组分TMB显色液，37 ℃避光作用10 min，最后加入2 mol/L H2SO4，每孔50 μL，终止反应，用酶标仪读OD450值，计算样品OD450 （S-N）值[样品OD450（S-N）值=样品OD450-阴性血清OD450]。试验重复2次，计算平均值。

2 结果与分析

2.1 重组质粒鉴定

提取重组菌1#、2#、3#、4#重组质粒，经Bam HⅠ和SalⅠ双酶切，1.5%琼脂糖凝胶电泳显示，均获得约5 900 bp的pET32a载体片段，同时分别产生282 bp、132 bp、174 bp和561 bp的插入片段，与预期目的片段长度相符，结果见图1。经测序，各载体中插入碱基序列编码的多肽氨基酸序列均包含有Pig/HLJ/2018毒株的CP204L蛋白氨基酸序列（GenBank QBH90581.1）。

2.2 重组蛋白氨基酸序列片段诱导表达和鉴定

经过IPTG诱导，pET32a-p30（8～101）、pET32-p30 （58～101）、pET32-p30 （101～158）、pET32-p30 （8～194）分别表达获得相对分子量32 000、25 000、33 000、50 000的重组蛋白氨基酸序列片段，分别命名为P-1#、P-2#、P-3#、P-4#，SDS-PAGE分析显示，P-1#和P-3#表达在诱导细菌超声波破碎的上清液中，P-4#表达在包涵体中，P-2#表达在上清液和包涵体中，但以表达在包涵体中为主（图2A）。诱导后的4种重组菌，与His单克隆抗体均有对应的特异性反应条带（图2B）。

2.3 重组蛋白氨基酸序列片段纯化

分别将表达在上清液中的P-1#和P-3#和表达在包涵体中的P-2#和P-4#进行Ni柱纯化，SDS-PAGE显示，获得4种纯化的p30重组蛋白氨基酸序列片段，各相对分子量符合预期（图3）。

2.4 p30蛋白氨基酸序列不同片段的反应原性

将纯化、透析后的4种重组蛋白氨基酸序列片段分别稀释至1.0 mg/L和0.1 mg/L进行包被，与不同稀释浓度下的ASFV阳性猪血清或p30免疫兔血清进行ELISA反应，结果显示2种蛋白质浓度包被下P-1#和P-4#，与40倍稀释ASFV阳性猪血清均有较好的免疫反应，随着血清稀释度增加，其ELISA反应OD450（S-N）值均显示出下降趋势；2种蛋白质浓度包被的P-2#，与40倍稀释的ASFV阳性猪血清ELISA反应OD450（S-N）值均较低，提示P-2#的抗原较弱。

由图4可见，4种重组蛋白氨基酸序列片段以1.0 mg/L进行包被，与系列稀释的p30免疫兔血清均有较好的免疫反应，随着血清稀释度增加，P-2#和P-3#的ELISA反应OD450（S-N）值略有下降；当蛋白质包被浓度为0.1 mg/L时，P-2#与p30免疫兔血清反应最弱，随着血清稀释度增加，P-3#的ELISA反应OD450（S-N）值显示出下降趋势，而P-1#和P-4#与系列稀释的p30免疫兔血清均保持较好的免疫反应，由此可见P-2#和P-3#诱导的兔多抗效价弱于P-1#和P-4#，硫氧还蛋白（Trx）与ASFV阳性猪血清和p30免疫兔血清均无反应。

3 讨论

非洲猪瘟是一种高传染性动物疫病，家猪感染后死亡率最高可达100%，20世纪90年代末，其流行仅限于非洲大陆和欧洲部分地区，2007年高加索地区出现非洲猪瘟疫情，加速了其在欧洲和亚洲的流行^[11-12]，现今ASFV基因Ⅱ毒株已经传至世界各大洲^[13]。目前，由于尚未有成熟的非洲猪瘟疫苗，对于该病的防控依赖于主动监测，ASFV可编码接近200种结构蛋白和非结构蛋白，其中结构蛋白p30分布于病毒囊膜的内膜，是ASFV主要的免疫原性蛋白之一，p30和p54的嵌合蛋白可产生中和性抗体^[14]，p30抗体对病毒内化有一定的抑制作用^[15]，因此较多诊断试剂和亚单位疫苗的研制均将p30蛋白列为重要的研究靶标。

通常以单克隆抗体来获取p30蛋白抗原信息，目前已制备出多株p30单克隆抗体，同时对p30蛋白的表位有了进一步认识^[16-17]。本研究通过对p30蛋白氨基酸序列进行分片段原核表达，直接分析ASFV阳性猪血清和p30免疫兔血清与不同p30蛋白氨基酸序列片段的反应原性，结果显示P-2#与p30免疫兔血清有免疫反应，但与ASFV阳性猪血清反应较弱，表明p30蛋白氨基酸序列中第58～101位片段的反应原性弱，而该片段内已被证实含有p30单克隆抗体识别的抗原表位（61～93 aa）^[18]。有研究以甲病毒表达的关联片段（61～110 aa）2次免疫10头猪，不能有效激活抗体产生（转阳比例1/10），以ASFV弱毒株OURT88/3继续攻毒后，才激活了抗体产生（转阳比例9/10）^[19]。综上，该片段存在的抗原表位（61～93 aa）可能不是p30的优势抗原表位，其抗体的产生需要该片段抗原的多次刺激。此外，甲病毒表达的p30的不同氨基酸片段，发现p30（1～100 aa）与ASFV弱毒株OURT88/3感染血清的反应原性最弱，同时推测p30蛋白的优势抗原区域集中在101～150 aa^[19]，而本研究以大肠杆菌原核表达p30蛋白不同氨基酸片段，发现P-1#（8～101 aa）与ASFV阳性猪血清的反应原性高于P-3#（101～158 aa），上述结果差异是否与蛋白质表达系统差异或者血清来源差异有关，值得后续进一步研究。

原核表达系统表达p30全长蛋白，用于建立ASFV抗体检测方法已见多次报道^[20-21]，但多数获得的蛋白质是以包涵体形式表达，尽管通过蛋白质复性可恢复部分活性，但复性效率较低。本研究通过大肠杆菌表达系统表达了p30蛋白氨基酸序列系列片段，其中P-1#（8～101 aa）和P-3#（101～158 aa）均是可溶性表达，同时P-1#（8～101 aa）能够与ASFV阳性猪血清和p30免疫兔血清有较好的反应原性，仅次于包涵体表达的P-4#（8～194 aa），结果表明P-1#（8～101 aa）可用于后续ASFV诊断候选靶抗原。此外，研制非洲猪瘟诊断试剂时，由于制备ASFV感染或免疫阳性猪血清有条件限制，常以蛋白质免疫猪或其他种属动物制备阳性血清替代，本研究中1.0 mg/L包被的P-2#与ASFV阳性猪血清反应较弱，但与p30免疫兔血清有较明显的免疫反应，表示经过抗原的多次免疫刺激可能存在较弱抗原性区域反应性提升的现象，因此建议筛选诊断优势抗原和优化诊断方法时，应慎重选用多次免疫血清去评价。

4 结论

本研究分析了非洲猪瘟病毒p30蛋白不同氨基酸序列片段反应原性，发现p30蛋白的8～101 aa氨基酸序列片段可在大肠杆菌表达系统中实现可溶性表达，同时该氨基酸序列为p30潜在抗原优势区域。

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（责任编辑：黄克玲）