不同品种沙棘叶片和果实中酚酸类及黄酮类成分的比较

关键词：沙棘；液质联用技术；酚酸类成分；黄酮类成分；种质资源

沙棘Hippophaerhamnoides是胡颓子科沙棘属落叶灌木或小乔木[1]。沙棘属植物分为6种12亚种，中国有6种8亚种，是世界上天然沙棘种质资源最丰富的国家，也是人工种植沙棘面积最大的国家[2]。沙棘具有较高的生态、经济、社会价值，在我国西北地区被大面积推广种植。沙棘叶片和果实含有丰富的生物活性成分，其酚酸类和黄酮类成分具有抗氧化[3]、抗癌细胞增殖[4]、抗糖尿病[5]等作用，已被广泛应用于食品、药品和保健品行业。

常用的酚酸类成分和黄酮类成分检测方法有分光光度法、高效液相色谱法（HPLC）、高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）。分光光度法常被用于检测总酚、总黄酮含量。戈素芬等[6]采用分光光度法测得辽西地区栽植的8个沙棘品种叶片中总酚含量为6.789～20.767mg/g，总黄酮含量为7.006～35.748mg/g；张东为等[7]采用分光光度法测得辽西地区18个优良沙棘单株果实的总酚含量为5.07～10.74mg/g，总黄酮含量为1.59～11.07mg/g。HPLC法可被用来测定样品酚酸类和黄酮类成分的组分及单一组分含量。Yan等[8]采用HPLC法测定了沙棘果实黄酮类成分芦丁、槲皮素、异鼠李素和山柰酚含量；张欣等[9]采用HPLC法测定了中国沙棘、阜杂1号沙棘和杂优54号沙棘叶中没食子酸的含量。采用HPLC法测定单次，仅能对少数几种酚酸类和黄酮成分进行定量，而高效液相色谱-串联质谱法因具有分析速度快、灵敏度高、结构解析能力强等优点正被广泛应用于天然产物的定性定量分析。一些研究者采用高效液相色谱-串联质谱法对沙棘叶片和果实中的黄酮类成分进行了研究。如蔡爽等[10]采用该方法对采自黑龙江的俄罗斯引进沙棘和杂交沙棘等52个沙棘品种叶片、果肉和种子的8种黄酮类成分进行了研究，结果发现沙棘不同部位黄酮类成分的组成和含量均存在明显差异，主要黄酮类成分均为芦丁、槲皮素和表没食子儿茶素。

俄罗斯是拥有沙棘先进育种技术的国家，其选育的品种是许多国家引种的首选。我国“三北”地区急需经济性状优异的沙棘品种，2012年水利部沙棘开发管理中心引进俄罗斯第三代沙棘良种，分别栽植于“三北”地区不同气候地理区，并从中优选出了适应强且经济性状优良的沙棘品种。通过杂交育种可选育出许多优良品种，服务于我国“三北”地区的沙棘资源建设和开发利用工作。但是当前针对筛选优势品种以实施定向育种及其开发利用的研究进展相对缓慢，鲜见相关报道。本研究中以在辽西地区表现优良的6个俄罗斯第三代大果沙棘、3个表现优良的杂交沙棘以及辽宁省旱地农林研究所自主选育的中国沙棘和目前生产上主栽大果沙棘品种‘深秋红’等11个沙棘品种为研究对象，采用HPLC-MS/MS法分析其叶片、果肉中10种酚酸类成分及8种黄酮类成分的含量，研究不同沙棘品种及不同器官间酚酸类成分和黄酮类成分组成及其含量的差异，以期为沙棘资源的定向育种和开发利用提供参考。

1材料与方法

1.1试验地概况

试验地位于辽宁省朝阳市南郊的辽宁省旱地农林研究所试验示范基地内。基地地势平坦，海拔184m，属暖温带半湿润半干旱气候。年平均气温8.3℃，日照充足，昼夜温差大，极端最低温度为-34.4℃，极端最高温度43.3℃，≥10℃的活动积温为3445.6～3720.4℃，无霜期145～165d，平均年降水量450mm，蒸发量2000mm，年平均日照2752～2950h。土壤类型为褐土，土壤质地为砂壤土，土层厚度0.6m，土壤有机质含量为0.8%，pH7.8。

1.2供试材料

选择基地内长势良好的11个沙棘品种作为研究对象，包括6个俄罗斯引进第三代沙棘品种（‘201301’‘201302’‘201307’‘201308’‘201309’‘2013016’[11]），3个杂交沙棘品种（‘杂雌优10号’‘QQHE19-01’‘QQHE19-06’），1个大果沙棘品种（‘深秋红’），1个中国沙棘品种（中红果），各沙棘品种的基本信息见表1。于2022年8—9月果实成熟期，分别在样株树冠上、中、下3个部位的东、南、西、北4个方向的内、外部采集叶片和果实，将样品充分混合，置于-80℃冰箱冷冻保存。

试剂：水杨酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸、原儿茶酸、丁香酸、对香豆酸、香草酸、没食子酸、咖啡酸、阿魏酸、异鼠李素、没食子儿茶素没食子酸酯、芦丁、表没食子儿茶素、槲皮素、木犀草素、山柰酚、柚皮苷标准品的纯度大于99.99%，均购自上海源叶生物科技有限公司；色谱甲醇、乙醇、石油醚购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.3样品中酚酸类及黄酮类成分提取

参考蔡爽等[10]的方法提取样品中的酚酸类及黄酮类成分。分别精确称取研磨后的沙棘叶片、果实粉末各2g，加入5mL75%的乙醇，25℃条件下超声辅助提取（200W）10min，4℃条件下4500r/min离心15min，将残渣采用相同方法提取2次，合并上清液。用石油醚萃取上清液3次，除色素。吸取0.5mL萃取液，用色谱甲醇稀释10倍，取1.0mL稀释液，使用微孔有机滤膜（孔径0.22μm）过滤，备用。

1.4样品中酚酸类及黄酮类成分分析

1.4.1HPLC-MS/MS分析

用DGU-20A液相色谱（日本岛津公司）-API3200三重四极杆质谱仪（美国AB公司）进行HPLC-MS/MS分析。色谱条件：色谱柱（日本岛津公司）为C18（2.1mm×50mm，1.9μm）；流速0.2mL/min，流动相A为超纯水，流动相B为色谱甲醇，柱温30℃，进样量2μL，等梯度洗脱5min。质谱条件：电喷雾离子源（ESI），负离子电离模式；质量扫描范围100～1000amu；干燥气（N2）流速3L/min，温度550℃；扫描方式为多重反应监测。10种酚酸类及8种黄酮类成分质谱分析参数见表2。

1.4.2标准曲线绘制

精确称取各标准品5.0mg，分别配制成质量浓度20、50、100、200、500、1000μg/L的混合标样。以定量离子峰面积为纵坐标、标准品溶液质量浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.4.3样品中酚酸类及黄酮类成分测定

按上述HPLC-MS/MS分析条件和方法对各样品提取液进行测定，进样量2μL，3次重复。以定量离子峰面积为指标，依据各酚酸类及黄酮类成分的标准曲线计算样品中各成分的含量。酚酸类成分总含量为10种酚酸类成分含量之和，黄酮类成分总含量为8种黄酮类成分含量之和。

1.5数据处理

利用SPSS25.0软件采用Duncan法进行差异显著性分析，利用Origin9.1软件绘图。

2结果与分析

2.1酚酸类及黄酮类标准品色谱图

将10种酚酸类标准品和8种黄酮类标准品溶液按照上述色谱和质谱条件进行HPLC-MS/MS分析，得到各标准品的质谱多反应监测（MRM）色谱（图1）。

2.2酚酸类及黄酮类标准品回归曲线线性关系

10种酚酸和8种黄酮类标准品回归曲线的线性关系良好，相关系数均大于0.99（表3）。

2.3沙棘叶片酚酸类和黄酮类成分

11个沙棘品种叶片均含有这18种成分（表4）。10种酚酸类物质含量存在显著差异（P＜0.05），总含量为1032.466～3354.984μg/g，各品种按照酚酸类物质含量由高到低排序依次为‘中红果’‘201309’‘201308’‘QQHE19-06’‘201316’‘201302’‘深秋红’‘201301’‘QQHE19-01’‘杂雌优10号’‘201307’。10种酚酸类成分的含量在不同品种沙棘叶片中差异较大（图2），其中阿魏酸、香草酸、对香豆酸和没食子酸是沙棘叶片的主要酚酸类成分，含量分别为255.574～648.996、227.217～877.757、250.038～457.189、87.722～1085.000μg/g，平均含量分别为396.763、362.470、333.154、279.448μg/g。肉桂酸、原儿茶酸、丁香酸、咖啡酸含量较低。各品种按照阿魏酸含量由高到低排序依次为‘中红果’‘201309’‘201301’‘201316’‘201302’‘201308’‘QQHE19-01’‘201307’‘深秋红’‘QQHE19-06’‘杂雌优10号’。叶片中香草酸、对香豆酸和没食子酸含量最高的品种同样为‘中红果’，含量分别为877.757、457.199、1085.000μg/g，特别是其没食子酸的含量，是含量第2高的‘201309’的2.13倍，是含量最低的‘201302’的12.37倍。

11个沙棘品种叶片8种黄酮类物质总含量差异显著（P＜0.05）（表4），为181.359～617.098μg/g，各品种按照黄酮类物质含量由高到低依次为‘中红果’‘201309’‘201301’‘杂雌优10号’‘深秋红’‘201307’‘201302’‘201316’‘201308’‘QQHE19-06’‘QQHE19-01’。8种黄酮类成分在不同品种沙棘叶片中差异较大（图2），其中芦丁是沙棘叶片主要的黄酮类成分，含量为87.065～334.689μg/g，平均含量为191.321μg/g，显著高于其他黄酮类成分，其含量在‘201309’品种叶片中最高（334.689μg/g），是含量最低品种‘QQHE19-01’的3.84倍。表没食子儿茶素、槲皮素、山柰酚、异鼠李素含量次之，分别为8.454～137.515、16.353～92.338、6.081～71.410、2.646～40.143μg/g，平均含量分别为36.540、39.473、28.881、20.913μg/g；没食子儿茶素没食子酸酯、木犀草素和柚皮苷含量较低。表没食子儿茶素含量较高的品种为‘201307’‘201301’‘中红果’，含量分别为137.515、76.775、74.055μg/g；槲皮素含量较高的品种为‘中红果’和‘深秋红’，含量分别为92.338、52.199μg/g；山柰酚含量较高的品种为‘201302’和‘深秋红’，含量分别为74.410、54.428μg/g；异鼠李素含量较高的品种为‘中红果’‘201306’‘深秋红’，含量分别为40.143、38.067、36.370μg/g。

基于酚酸类和黄酮类物质的高含量，‘中红果’和‘201309’品种沙棘叶片在营养价值和药用价值方面具有显著优势，可被作为育种和栽培的重点对象。利用具有高含量的酚酸类和黄酮类物质的沙棘品种，可以开发出一系列具有抗氧化、抗炎、抗癌等功效的功能性食品和药品，如沙棘提取物、沙棘茶、沙棘饮料等。

2.4沙棘果实酚酸类和黄酮类成分

在11个沙棘品种果实样品中检出部分酚酸类成分和8种黄酮类成分，且含量差异显著（P＜0.05）（表4）。不同品种沙棘果实酚酸类成分总含量为25.002～98.009μg/g，各品种按照酚酸类成分含量由高到低排序依次为‘杂雌优10号’‘201308’‘201302’‘QQHE19-01’‘201301’‘201316’‘深秋红’‘QQHE19-06’‘中红果’‘201309’‘201307’。‘杂雌优10号’果实酚酸类成分总含量最高（98.009μg/g），其次是‘201308’（77.503μg/g）；‘201307’酚酸类成分总含量最低（25.002μg/g），仅为‘杂雌优10号’的25.51%。原儿茶酸、丁香酸、对香豆酸、没食子酸、咖啡酸5种酚酸类成分均在11个沙棘品种果实中被检测出，而其余5种酚酸类成分仅存在于部分品种果实中，大多数品种果实中未检出水杨酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸和香草酸。10种酚酸类成分在不同品种沙棘果实中含量差异较大（图2），其中对香豆酸是沙棘果实主要酚酸类成分，含量14.629～64.327μg/g，平均含量为29.585μg/g，显著高于其他酚酸类成分。‘杂雌优10号’所含酚酸类成分种类最多，共检测出9种，显示出其成分的丰富性。

11个沙棘品种果实中8种黄酮类成分总含量差异显著（P＜0.05）（表4），果实总黄酮含量为54.219～351.622μg/g，各品种按照黄酮类成分含量由高到低排序依次为‘201301’‘201308’‘QQHE19-01’‘中红果’‘201307’‘QQHE19-06’‘201316’‘杂雌优10号’‘201309’‘201302’‘深秋红’。‘201301’果实中总黄酮含量最高（351.622μg/g），其次是‘201308’（189.981μg/g）、‘QQHE19-01’（149.689μg/g）、‘中红果’（113.679μg/g）和‘201307’（102.916μg/g）；‘深秋红’果实总黄酮含量最低（54.219μg/g），仅为‘201301’的15.42%。8种黄酮类成分在不同品种沙棘果实中含量差异较大（图2），其中芦丁是沙棘果实主要黄酮类成分，含量为18.281～317.341μg/g，平均含量81.200μg/g，显著高于其他黄酮类成分；异鼠李素、表没食子儿茶素、槲皮素、没食子儿茶素没食子酸酯含量次之，分别为2.303～26.401、5.867～32.671、4.328～16.076、7.420～8.001μg/g，平均含量分别为9.644、13.914、7.140、7.640μg/g。各品种按照芦丁含量由高到低排序依次为‘201301’‘201308’‘QQHE19-01’‘201307’‘201316’‘201309’‘QQHE19-06’‘201302’‘杂雌优10号’‘中红果’‘深秋红’。‘201301’含量最高，为‘深秋红’的17.36倍。

‘杂雌优10号’和‘201301’具有高含量的酚酸类和黄酮类成分，可针对其特性开发功能性食品或保健品，如沙棘果粉、沙棘果汁、沙棘提取物胶囊等，满足消费者对健康产品的需求。二者可作为推广种植的沙棘品种。

3讨论与结论

沙棘不同器官酚酸类和黄酮类成分的组分及其含量受品种、栽培地点和气候条件等影响。丁金等[12]采用HPLC法测定采自青海地区中国沙棘叶片酚酸类成分，结果发现阿魏酸、对香豆酸、没食子酸含量分别为4～105、85～237、32～110μg/g，其含量低于本研究结果；张欣等[9]测得的山西省野生中国沙棘叶片没食子酸含量为2363.3μg/g，其含量高于本研究结果。蔡爽等[10]研究的沙棘和杂交沙棘等52个品种中，涉及本研究中采用的‘201301’‘201307’‘201308’‘201309’‘201316’这5个品种，均源自俄罗斯引进品种，但栽培地点不同，前者采样地点为黑龙江绥化地区。本研究中这5个品种沙棘叶片中没食子儿茶素没食子酸酯、芦丁、表没食子儿茶素、木犀草素、柚皮苷含量高于蔡爽等[10]的研究结果，而槲皮素含量显著低于后者的研究结果，说明辽宁朝阳地区的栽培条件更有利于沙棘叶片芦丁和表没食子儿茶素等黄酮类成分的积累，而黑龙江绥化地区的栽培条件更有利于沙棘叶片槲皮素的积累。本研究中11个沙棘品种果实主要酚酸类成分为对香豆酸，其含量显著高于其他酚酸类成分，其次为咖啡酸和没食子酸。Arimboor等[13]对印度沙棘果实9种酚酸类成分进行了研究，结果发现沙棘果实游离酚酸含量分别为没食子酸88μg/g、水杨酸46μg/g、原儿茶酸33μg/g、阿魏酸13μg/g、对香豆酸11μg/g、对羟基苯甲酸8μg/g、肉桂酸7μg/g、香草酸5μg/g、咖啡酸3μg/g，其中对香豆酸、咖啡酸含量低于本研究结果，香草酸、肉桂酸含量在本研究结果范围内，其余5种酚酸含量均高于本研究结果。

本研究中11个沙棘品种叶片中主要酚酸类成分为阿魏酸、香草酸、对香豆酸和没食子酸，主要黄酮类成分为芦丁。这些成分具有抗真菌[5]、抗氧化[14]、降低阿尔茨海默病发病风险[15]、调节糖脂代谢[16]、治疗动脉粥样硬化[17]、增强免疫力[18]、抗癌细胞增殖[19]等多种生物学功能。在实际生产过程中，可依据不同器官中主要酚酸类和黄酮类成分及其功能的差异，有针对性地进行沙棘食品、药品和保健品的开发。沙棘果实中酚酸类成分因品种而异，如‘杂雌优10号’含9种酚酸，‘201307’仅含5种。这主要是由沙棘品种遗传特性和代谢途径不同导致。本研究结果揭示了酚酸类和黄酮类成分在沙棘不同器官的分布与含量，为给沙棘资源的高效利用提供参考，未来研究中将综合考虑研究生长周期、环境因子等因素对酚酸类和黄酮类成分分布与含量的影响。

酚酸类成分和黄酮类成分是沙棘叶片和果实的主要活性成分，本研究中采用优化的HPLC-MS/MS法检测出11个沙棘品种叶片和果实中酚酸类及黄酮类成分及其含量。就品种来看，‘中红果’和‘201309’叶片中的酚酸类及黄酮类含量较高，‘杂雌优10号’和‘201308’果实中酚酸类含量较高，‘201301’和‘201308’果实中黄酮类含量高，可进行定向培育和示范推广。沙棘叶片是酚酸类和黄酮类成分的主要富集部位，其含量显著高于果实。因此，在开发和利用酚酸及黄酮资源时，应优先考虑将沙棘叶片作为提取原料。沙棘叶片主要酚酸类成分为阿魏酸、香草酸、对香豆酸和没食子酸，果实中主要酚酸类成分为对香豆酸，叶片和果实主要黄酮类成分均为芦丁，在后续试验中可针对这些成分进行深入研究。