赤峰地区乳腺癌HER-2基因FISH检测及临床意义

摘 要：目的：通过FISH检测赤峰地区部分乳腺癌患者组织中HER-2基因的扩增情况并结合临床病理特征探讨其具有的临床意义。方法：收集从2019年4月至2023年12月的赤峰市肿瘤医院中的156例乳腺癌病例样本，并从中选出49例用于FISH检测的样本。使用免疫组织化学技术及荧光原位杂交技术评估这些样本中的HER-2蛋白表现及其基因扩增状况，并对它们与疾病进程的关系进行深入探讨。结果：在这49例做FISH检测的病人中，共有8人存在HER-2基因扩增的现象，扩增率为16.3%（8/49），对做FISH检测的49例乳腺癌患者的病理参数进行单因素分析，发现HER-2基因扩增状态与年龄、肿瘤大小、肿瘤位置、有无淋巴结转移等因素均无相关性（Pgt;0.05）。结论：（1）结合赤峰地区部分乳腺癌患者的情况，FISH检测仍是判断HER-2基因有无扩增最精确的办法。（2）对IHC评分为（2+）的病人，必须进一步采用FISH检测来确认HER-2基因的扩增状况，而对被评为IHC评分为（3+）的病人，同样也需要利用FISH检测来明确诊断其HER-2基因的扩增状况，从而为其制定合适的治疗策略。（3）IHC和FISH这两种技术的联合运用能大大提升HER-2状态的准确度，有助于向当地居民提供更为精确的HER-2状态检测结果，进而更好地实施个性化的治疗方案和预测病情发展趋势，同时也能更加科学合理地指导赫赛汀药物的使用。

关键词：乳腺癌；人类表皮生长因子受体-2；荧光原位杂交；免疫组织化学染色

中图分类号：R737.9" 文献标识码：A" 文章编号：1673-260X（2024）12-0040-06

收稿日期：2024-09-09

通信作者：李丹丹，女，硕士，主治医师。邮箱：109821678@qq.com。

基金项目：赤峰市自然科学科研课题（SZR2023167）

根据世卫组织的报告《Global cancer statistics 2022》，每年有超过两千万的新发病案例被诊断为各种类型的癌症。在这之中，乳腺癌的数量惊人，约占总数的四分之一以上[1]。崔旭初[2]等及迟艳玲[3]等的报道显示，在赤峰市女性主要恶性肿瘤死因顺位排序中，乳腺癌位居第四位，严重危害赤峰地区女性的健康与生命。

HER-2即为人类表皮生长因子受体-2（Human Epidermal Growth Factor Receptor-2），它是一个存在于第17条染色体的远端部分上的原癌基因。该蛋白质过量产生或其拷贝数增多会引发恶性疾病的发展，并增强它的扩散能力；同时也会导致更高的风险出现，如病灶迁移，并且会影响患者的诊断结果、病情进展情况及其预期寿命等重要指标，决定着选择针对性的抗瘤药剂的问题[4]。大量的医学实践证明了HER-2是预测乳腺癌患者生存期的重要依据之一[5，6]。

赫赛汀（Herceptin）又称曲妥珠单抗（Trastuzumab），是一种能特异性地作用于HER-2的单抗靶向药物，能高效地阻断依赖HER-2的肿瘤细胞的增殖和生存能力[7]。研究表明，HER-2扩增的乳腺癌患者可以从赫赛汀治疗中获益，而未扩增的患者疗效不明显[8-10]。

在美国食物及药物管理局（FDA）认证下，免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）法和荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）被广泛应用于检测HER-2的状态[11]。FISH检测是判断HER-2状态的金标准[12]。由于HER-2基因FISH检测与乳腺癌中HER-2基因扩增的关系及其对疾病病理状态的影响至关重要[13]，而目前关于赤峰地区的乳腺癌HER-2基因FISH检测的研究还处于空白阶段，所以本研究针对部分乳腺癌病人实施HER-2基因FISH检测并探讨其所具有的临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2019年4月至2023年12月间赤峰市肿瘤医院手术切除的乳腺癌标本156例，其中做FISH检测的49例（检测率为31.4%，49/156），术前或穿刺前未接受过任何治疗，均经病理学明确诊断为浸润性乳腺癌。患者均为女性，年龄28～84岁，平均53.4±10.6岁。所有病例标本均在离体后60min内进行10%甲醛固定石蜡包埋处理，组织切片厚度4μm。本研究材料均使用手术切除标本，其他相关临床资料均取自患者病理报告及病历资料。本次研究所用标本的临床使用申请已获得医院伦理委员会审核批准。排除标准：（1）合并严重的内科疾病、其他生殖系统症状、凝血功能异常者；（2）患有血液系统疾病者；（3）长期服用抗凝药物者；（4）病理及临床资料缺损者。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂与仪器

HER2基因检测试剂盒购买于厦门龙进生物科技有限公司，PBS缓冲液、DAB显色剂均购买于福州迈新生物技术开发有限公司，原位杂交仪（Leica，S500-24）购买于美国雅培ThermoBrite公司。

1.2.2 免疫组织化学（IHC）染色

石蜡连续切片，厚度为4μm，使用防脱载玻片进行捞片。将捞好的切片放入烤箱融蜡，72℃烤片3h，拿出后放到二甲苯溶液脱蜡，6min/缸，共2缸。放在梯度酒精浓度为95%、85%的染色缸内进行水化，3min/缸。接着用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗5次切片，2min/次。之后进行高压修复，在高压锅中加入1L纯水和20mL免疫组化抗原修复缓冲液（pH=9.0）煮沸，沸腾后把片子放入锅中保温20min，自然冷却10min，冷水冲凉至室温，用免疫组化笔画圈（要稍超过染色组织）。接下来用PBS缓冲液进行三次洗涤并将其甩干，然后加入适量的一抗（兔抗HER-2蛋白），存放在冰箱（4℃）中过夜。取出切片，再次使用PBS缓冲液清洁并甩干。最后滴上适量的二抗（鼠抗兔IgG蛋白），等待15～20min。加二氨基联苯胺（Diaminobenzidine，DAB）显色剂显色，时间5min，之后用自来水冲洗。接着将切片放在苏木素的染色缸中复染细胞核5min，PBS缓冲液清洗3min。之后将切片放在已经加入自来水的盆中，大幅度摇晃水洗。接着脱水，将切片放在无水乙醇的染色缸中，2min/缸，共2缸。放在二甲苯中透明后，滴加中性树胶，盖上盖玻片，烤箱72℃烤片30min，拿出切片，贴上标签。在显微镜下进行观察、图像分析、拍照。

1.2.3 荧光原位杂交（FISH）

1.2.3.1 标本预处理

（1）准备工作。65℃烤片过夜；将盛有纯化水的染色缸（操作中的染色缸均为5片立式染色缸）置于水浴锅中预热至95～98℃；将盛有40mL 2×氯化钠柠檬酸缓冲液（Saline Sodium Citrate buffer，SSC）的染色缸置于水浴锅中预热至37℃，作为蛋白酶K的工作缓冲液。

（2）操作步骤。组织切片按下列顺序依次处理。用松节油或二甲苯脱蜡，脱蜡3次，每次10min；用100%无水乙醇洗脱松节油或二甲苯，洗脱2次，每次5min；放入90%乙醇、70%乙醇、50%乙醇及纯化水中，各2min；在95～98℃纯化水中，待染色缸内温度回升至95～98℃后计时20min；在40mL 37℃蛋白酶K工作液（20～200μg/mL 2×SSC）中消化约8～30min；用纯化水漂洗，5min；用70%乙醇、90%乙醇、100%乙醇脱水，各2min；将切片完全风干或置于50℃环境中2～5min。

1.2.3.2 标本杂交

将HER2/CEN17探针从-20℃取出，平衡至室温，简单离心；取10μL HER2/CEN17探针滴加于切片杂交区域，加盖22×22mm盖玻片，排除气泡。探针使用后立即放回-20℃保存；用橡胶胶水封住盖玻片的四周，避免橡胶胶水产生气泡；待橡胶胶水风干后，检查盖玻片是否密封，如未密封，再滴加橡胶胶水于缺口处，确保盖玻片四周密封，再风干；将切片置于原位杂交仪中，设定程序：79℃变性5min，42℃杂交4小时以上（可延长至72小时）。

1.2.3.3 标本洗涤

（1）准备工作。配制40mL洗脱液Ⅰ（40mL 2×SSC、40mL Tween-20）、40mL洗脱液Ⅱ（2mL 2×SSC、40mL Tween-20、38mL纯化水）；将洗脱液II预热至55～65℃，待用。

（2）操作步骤。待杂交结束后，从原位杂交仪中取出切片，用镊子小心移去橡胶胶水与盖玻片；在洗脱液I中振荡漂洗5min；在55～65℃洗脱液Ⅱ中浸洗5min，放入切片后染色缸内温度回升至55～65℃开始计时，每分钟晃动切片数秒；在2×SSC中漂洗2min；在70%乙醇中脱水2min；室温下完全风干。

1.2.3.4 标本复染及观察

取10μL抗淬灭/复染剂（4，6-二脒基-2-苯基吲哚1 000ng/mL、对苯二胺800ng/mL溶于油和磷酸缓冲盐溶液pH=7.4）滴加于切片的杂交区域（抗淬灭/复染剂临用前取出，用后立即放回-20℃保存），加盖22×22mm盖玻片，在荧光显微镜下进行观察。

1.2.4 统计学方法

研究数据采用SPSS 26.0统计软件，结果用例数和概率表示，组间比较用卡方检验或确切概率法，若Plt;0.05则证明数据有统计学意义。

2 结果

2.1 IHC法检测乳腺癌HER-2蛋白表达情况

乳腺癌组织的石蜡切片上，HER-2蛋白的IHC法表达结果如图1，根据IHC判断标准[13]，判读A为HER-2蛋白表达（0）；B为HER-2蛋白表达（1+）；C为HER-2蛋白表达（2+）；D为HER-2蛋白表达（3+）。

2.2 FISH法检测乳腺癌HER-2基因扩增情况

乳腺癌组织的石蜡切片上，HER-2基因的FISH探针检测结果如图2，HER-2基因的FISH探针检测簇状扩增结果如图A，癌细胞核红色的信号点（为正方形所指）连接成簇时，根据判断标准[13]直接判读为HER-2基因扩增；图B中癌细胞核红色的信号点（为正方形所指）的数目相对于绿色信号点（为圆形所指）的数目之比为（HER-2/CEP17）3.43gt;2.0，且平均HER-2基因拷贝数为7.9gt;4.0，根据判断标准判读图B为HER-2基因扩增；图C中癌细胞核红色的信号点（为正方形所指）的数目相对于绿色信号点（为圆形所指）的数目之比为（HER-2/CEP17）1.22lt;2.0，且平均HER-2基因拷贝数为3.05lt;4.0，根据判读标准判读为未扩增。

2.3 IHC和FISH检测检测结果符合率

在挑选出做FISH检测的49例的患者中，HER-2基因扩增8例，扩增率为16.3%，参考表1的数据。本研究发现，在那些同时使用了IHC法来评估乳腺癌的HER-2蛋白表现的患者群体里，有4位患者的HER-2蛋白呈现出（1+）的表现，而这四位的HER-2基因没有扩增；另外37名患者显示的是（2+）的HER-2蛋白表现，6人存在着HER-2基因的扩增，31人的HER-2基因没有扩增。最后，还有两位患者显示出了（3+）的HER-2蛋白表现，其中1人是HER-2基因的扩增，另1人是未扩增的情况。未用IHC检测乳腺癌HER-2蛋白表达的有6人，其中1人扩增，另外5人展现出不扩增的情况。得出IHC HER-2（0/1+）与FISH阴性符合率为100%（4/4），IHC HER-2（2+）与FISH阳性符合率为16.2%（6/37），IHC HER-2（3+）与FISH阳性符合率为50%（1/2）。

2.4 乳腺癌组织HER-2基因扩增与临床病理特征关系

对做FISH检测的49例乳腺癌患者的疾病病理状态进行统计分析得出：HER-2基因扩增状态与年龄、肿瘤大小、有无淋巴结转移、肿瘤位置等因素均无相关性（Pgt;0.05），见表2。

3 讨论

由于在临床中使用赫赛汀来治疗HER-2过量的乳腺癌患者的成功案例越来越多，因此对于准确识别和解读HER-2状况的要求也在不断增加。目前临床实践检测HER-2基因的两种方法主要是IHC染色法和FISH检测[11]。IHC方法利用抗原和抗体之间的相互作用，识别并量化肿瘤细胞表面抗原的方式。然而免疫组化法有一定的弊端，其依赖于对样本的主观解读，同一块切片可能因病理医师间的差异而产生多种解释；另外，实验过程中的各种变数也会干扰结果的评估，如福尔马林处理会降低或消除蛋白质抗原的活性，酒精暴露会导致其他非特异性的蛋白质抗原染色等。同时，不同批号的抗体浓度也有所变动[14，15]。为了避免这些潜在的影响，病理科必须实施严谨的质量管控措施，包括标准化的操作流程和评级系统。定期执行质控和管理工作有助于提升IHC测试结果的一致性和可靠度。

对比IHC染色，FISH技术具有灵敏度高，结果为双色荧光信号，具有避免绿色荧光干扰的优势，通过使用FISH技术可以准确地评估患者的HER-2基因扩增状况[16]。然而基因表达调节过程相当复杂，例如癌症等原因可能引发部分基因的扩增，但是这不一定意味着这些基因会过度表达蛋白质。另外，针对乳腺癌的靶向疗法中，赫赛汀能够与乳腺癌细胞表面的HER-2受体相互作用并阻止或减缓肿瘤细胞的生长及生存能力[17]。根据中国的《乳腺癌HER2检测指南（2019年版本）》[13]，已经废除了对FISH判断结果中的疑惑，如果FISH HER-2/CEP17比例低于2，且平均HER-2拷贝数量为4至6个每细胞之间，那么就需要结合IHC的结果来做出最终决定。随着医疗实践经验的丰富和新研究数据的发现，美国临床肿瘤学会（American Society of Clinical Oncology，ASCO）美国病理学家学会（College of American Pathologists，CAP）指南对于HER-2阳性的阈值也一直在调整。

49例乳腺癌石蜡标本中，在新标准下[13]，本研究HER-2基因扩增率为16.3%，低于国外[18，19]报道的25%，国内李昕等[20]报道的30.96%，这可能与地区、费用、仪器等的差异有关。本研究得出IHC评分为（0/1+）与FISH检测的阴性符合率为100%（4/4），提示IHC检测HER-2结果为（0/1+）的患者与FISH检测高度一致，略高于王清等[21]报道的97.1%，并且本研究的病例中未出现相关文献[21，22]报道的IHC评分为（0/1+）的患者有HER-2基因扩增的病例，这样的结果可能与样本数量少有关。IHC评分为（2+）与FISH检测的阳性符合率为16.2%（6/37），与MAGDALENA BT等[23]人的研究结果基本符合。这样的结果表明IHC检测HER-2状态为（2+）的患者，IHC与FISH的检测结果存在较大差异，存在假阳性或者假阴性的状态，所以在临床实践中，出现经IHC检测初筛HER-2状态为（2+）的患者时，为了确保此患者能够用靶向药物进行治疗，必须进行FISH检测来确定HER-2基因的状态。IHC评分为（3+）与FISH检测的阳性符合率为50%（1/2例），虽然低于要建超[4]96.8%的报道，但是本研究也存在HER-2（3+）的患者FISH检测不扩增。据研究表明[4，13]，用赫赛汀治疗的前提为IHC评分为（3+）或者FISH检测为扩增。结合本研究的结果，如果对这位IHC评分为（3+）的患者不再进行FISH检测而直接用靶向药物予以治疗，但最终经金标准FISH检测为不扩增，那么实际结果是此患者不能从靶向药物治疗中获益。本研究与一些专家[24，25]均认为结合IHC和FISH的方法是最有效的检测方法。

已有的研究资料显示，中国的乳腺癌发病高峰年龄通常出现在45至55岁的区间内，而且年轻患者的生存状况往往更糟糕，这使得年龄成了预测疾病结果的一个重要风险因子[26，27]，本研究年龄经单因素分析与HER-2基因扩增无相关性（Pgt;0.05），与相关文献一致[28]。本研究发现在肿块发生位置上，左乳肿块发生率略大于右乳肿块发生率，同样经单因素分析不具有统计学意义（Pgt;0.05），与相关文献结果一致[27]。通常情况下，乳腺癌患者的初次就医主因多为无症状的肿块，且肿块的大小与其预后状况密切相关。然而，本研究结果显示，HER-2基因扩增和肿瘤大小并无明显关联（Pgt;0.05）。相反，已有其他研究指出，当肿瘤直径超过两厘米时，其发生HER-2基因扩增的风险会显著增加[28]。此外，王鸿雁等[29]人还报道HER-2基因扩增还可能与淋巴结转移有关，但张明帅等[28]人的报道认为HER-2基因扩增状态与淋巴结有无转移无关，本研究结果也显示HER-2基因扩增状态与淋巴结有无转移无关（Pgt;0.05）。总之，目前关于HER-2基因扩增情况与哪些病理特征相关联，是一个争论性问题，样本数量较少可能是诸多原因之一，所以本研究有待加大样本量以展开更深层次的研究。

综上所述，本研究得出：（1）结合赤峰地区部分乳腺癌患者的情况，FISH检测仍是判断HER-2基因有无扩增最精确的办法。（2）对于被评为IHC评分为（2+）的病人，必须进一步采用FISH检测来确认HER-2基因的扩增状况，而对于被评为IHC评分为（3+）的病人，同样也需要利用FISH检测来明确诊断其HER-2基因的扩增状况，从而为其制定合适的治疗策略。（3）IHC和FISH这两种技术的联合运用能大大提升HER-2状态的准确度，有助于向当地居民提供更为精确的HER-2状态检测结果，进而更好地对其实施个性化的治疗方案和预测病情发展趋势，同时也能更加科学合理地指导赫赛汀药物的使用。

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