蛋白质相互作用技术在分子水平的应用

【摘要】基于蛋白复合物在钠离子通道相关疾病中的调控作用，本文综述了蛋白质相互作用构建蛋白质关系的网络和生物学通路中涉及的体内和体外相关检测方法，如酵母双杂交系统、双分子荧光互补、免疫共沉淀技术、融合蛋白Pull-Down技术、单分子下拉、高通量蛋白质芯片、微生物质谱、串联亲和蛋白纯化，以及以生物信息学为主的研究方法，并通过相关检测技术在大分子蛋白复合物中的应用获得新的靶点。

【关键词】蛋白质-蛋白质相互作用；酵母双杂交系统；双分子荧光互补；免疫共沉淀技术；串联亲和蛋白纯化

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.06.055

The Application of Protein Interaction Technology at the Molecular Level

HAN Juanzhu1*， YANG Wenyao2，3， GAO Duo1

（1.Liaoning Inspection， Examination&Certification〔Liaoning Institute forAgro-product Veterinary Drugs and Feed Control〕， Liaoning Key Laboratory of Livestock Product Safety， Shenyang 110036， China； 2.Liaoning Chengda Biotechnology Co.， Ltd.，Shenyang 110179， China； 3.Shenyang Pharmaceutical University School of Life Sciences and Biopharmaceuticals， Shenyang 110016，China）

Abstract： Based on the regulatory role of protein complexes in sodium ion channel related diseases， this article reviews the in vivo and in vitro detection methods involved in the construction of protein relationship networks and biological pathways through protein interactions： yeast two hybrid system， bimolecular fluorescence complementarity， immune coprecipitation technology， fusion protein Pull-Down technology， single-molecule pull-down， high-throughput protein chip， microbial mass spectrometry， tandem affinity protein purification， and bioinformatics based research methods. Through the application of relevant detection technologies in large molecule protein complexes， new targets are obtained.

Keywords： protein protein interaction； Y2H； BiFC； Co-IP； TAP

蛋白质相互作用（protein-protein interactions，PPI）技术是一种随着生物技术进步而发展的新型研究方法，它是新型靶点药物研发的关键技术，同时也是研究药物副反应的基础方法，为药物治疗开辟了新的道路。通过建立蛋白质关系的化学网络和生物学通道，可以鉴定由功能失调或病变引起的异常表达蛋白，从而发现与病毒的小分子相互作用机制，并明确治疗干预的靶点。

蛋白质之间的动态相互作用几乎指导了细胞功能的各个方面。了解活细胞中大分子的相互作用是破解它们在细胞功能和调节中作用的关键。单个蛋白质也是多种蛋白质网络的一部分，这使得分离出发生在细胞结构中的蛋白质-蛋白质相互作用的各种排列具有挑战性。PPI检测技术主要包括体内检测和体外检测两个方面。

1体内技术研究

1.1酵母双杂交系统

酵母双杂交系统（Yeast-hybrid system，Y2H）是1989年Fields和Song提出并创立的一种直接在酵母细胞内研究蛋白质相互作用的遗传学新方法。这一技术在细胞分裂调节和凋亡、信号通路转导、癌症相关基因表达产物作用、基因表达调控元件及蛋白特异性等方向带来很多热点研究。其主要用于互作蛋白的筛选，适用方向由蛋白质与蛋白质之间扩展到蛋白质与DNA、RNA及其他小分子相互作用，对新作用蛋白的发现起到巨大的推动作用。

Y2H的建立是基于真核生物调控转录起始过程的认识，起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录因子，如酵母转录因子GAL4，其在结构上包含两个主要部分：一是DNA结合结构域（BD），二是转录激活结构域（AD）。待测蛋白与AD、BD融合表达形成Prey-AD和bait-BD，只有通过诱饵蛋白与目标蛋白在细胞内的相互作用，AD和BD之间会相互吸引，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，形成完整的转录因子，并激活酵母基因组中的报告基因进行转录。在实验时只要通过观察报告基因的表达水平就能判断蛋白质复合物之间是否存在相互作用。Y2H系统能够真实反映体内蛋白质复合物之间的相互作用，蛋白表型和基因型联系紧密，联用简便高效的Gateway表达载体构建方法，因而在大规模PPI研究中的应用前景具有普遍性。然而，尽管传统二代Y2H系统在分析PPI及小分子药物蛋白靶标探索中的应用认可度高，但无法提供PPI的密切程度且易出现假阳性，故可结合免疫共沉淀或GST-pull down试验进行验证，但高通量筛选方面仍具有局限性。

1.2双分子荧光互补

蛋白质相互作用是产生生物调节特异性的基本机制，活细胞中蛋白质相互作用的研究具有特别重要的意义，因为发生在特定细胞中的相互作用取决于细胞中存在的蛋白质的完整补充以及影响细胞的外部刺激。双分子荧光互补（BiFC）分析可以直接可视化活细胞中的蛋白质相互作用。Hu等[3]在2002年提出了BiFC技术，以最短的时间、最易于理解的方式说明蛋白在细胞中的位置跟踪和蛋白与蛋白之间的作用关系。

BiFC测定基于荧光蛋白的两个非荧光片段之间的关联，它们通过融合片段的蛋白质之间的相互作用而彼此接近。在许多不同的细胞类型和生物体中，使用BiFC测定法可以观察到许多蛋白质相互作用。按照规则，标记分子主要采用荧光报告蛋白中没用荧光的片段，通过细胞内融合技术共表达携带标记分子的诱饵蛋白和捕获蛋白。

Paul等[4]为了寻找FGF14∶Nav1.6复合物上游的关键细胞途径，通过使用分裂萤光素酶互补测定法稳定地重建了FGF14∶Nav1.6复合物，并对267种FDA批准的化合物进行了高通量筛选（HTS），这些化合物能够靶向细胞信号转导途径中的已知介体。在筛选过程中，5种化合物被验证并确认具有活性，其中，酪氨酸激酶抑制剂来舒替尼排名最高，表现出对FGF14∶Nav1.6装配的亚微摩尔抑制作用。BiFC技术已被国际上众多实验室采用，在荧光显微镜下，通过显示器可以看到在生理状态下目标蛋白的作用情况，包括具体的作用部位、作用的时间、作用的程度、所形成蛋白质复合物的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等。在活细胞内证明蛋白质的相互作用对研究蛋白质相互作用有重要意义。

2体外技术研究

2.1免疫共沉淀技术

目前，体外研究确定蛋白质之间相互作用的黄金标准之一是Co-IP测定，它依赖于相互作用蛋白质的亲和基础上的共同纯化，然后通过western blot或质谱法进行鉴定。它利用特异性抗体与抗原的结合来确定蛋白质之间的互动。诱饵蛋白抗体加入后，将猎物蛋白在免疫沉淀反应的作用下被共沉淀下来，然后使用SDS-PAGE或二维电泳并结合微生物质谱鉴定，得到猎物蛋白的具体信息。Jia J等[5]使用共免疫沉淀与质谱联用（Co-IP/MS）技术鉴定出23种与母羊卵巢提取物中的FecB特异性相互作用的蛋白质。所选PPI的生物信息学分析表明，FecB主要通过卵巢中的信号传导与其他几种BMP相关。

2.2融合蛋白Pull-Down技术（GST pull-down）

用传统的免疫沉淀法很难确定哪些蛋白质在生理复合体中有多少拷贝。此外，在样品制备和测量之间往往消耗大量时间并且经过多个操作步骤，因而在分析之前体内相互作用的保存程度存在不确定性。通过了解蛋白之间的相互作用能够掌握细胞功能和调控的机制，揭示生命最基本的作用方式。GST Pull-Down技术采用诱饵蛋白（Bait protein）和标签蛋白（生物素-、His-或GST-），通过谷胱甘肽和GST之间的特异性关系在细菌、细胞体系中进行表达，在色谱柱上固定诱饵蛋白，从而特异性结合捕获细胞中互相作用的靶蛋白。Kordiukova MIu等[6]通过GST融合的蛋白，即人GST-SURF6和与C末端有85%同源性的小鼠Surf6的保守C末端结构域、人SURF6保守域（GST-Surf6-dom）的鉴定，以鉴定人HeLa细胞中与SURF6相互作用的蛋白质。

2.3单分子下拉

通常，为了研究蛋白质-蛋白质相互作用，常采用的技术是传统的共免疫沉淀（Co-IP/pulldown）进行蛋白质印迹。然而，该技术没有提供关于PPI动力学和化学计量的精确信息。另外，传统Co-IP的敏感性不适合检查稀有细胞中的PPI。鉴于Co-IP方面存在的不足，Jain A等[7]建立了单分子下拉（SiMPull）方法，该方法能够分析出一种蛋白的多种关联蛋白，以单个分子的分辨率来证明蛋白质复合体的特性和特征，以及化学计量特性和特征，同时通过分层次的光漂白来分析确定化学计量特性和特征。该方法将荧光显微方法与pulldown方法结合在一起，直观获得蛋白复合体的图像，特别擅长组织内、细胞器和膜蛋白的内源性蛋白分析。目前，SiMPull分析用于研究稀有细胞，为研究细胞途径中的蛋白复合物提供了一种用时少、检测限低、准确率高的方法。

2.4串联亲和纯化

在研究蛋白质相互作用的新技术革命中，Rigaut等[10]提出了串联亲和纯化技术（TAP），主要应用在生理状态下。该方法的特点是采用了两个相连的标签，提高了特异性，排除了更多干扰。该方法通过让目标蛋白融合TAP特异性标签，再经过串联亲和层析获得目标蛋白质复合物，经过二维电泳和微生物质谱鉴定等技术，得到更多的蛋白信息。该方法耗时短，结果准确性高，能够应用在细菌、真菌、病毒、昆虫等实验载体。

2.5质谱技术在蛋白质互动分析过程中的运用

质谱技术（MS）被广泛应用于包括人类蛋白质组在内的各种细胞、组织和生物体的综合分析。Petricoin等[12]将低分子量蛋白质谱引入癌症蛋白质组学。稳定同位素标记是一种标记定量技术，在相同的质谱运行条件下对肽的谱特征分别定量。目前，常用的同位素标记分别为2H、13C、15N和18O。加入同位素标记的方法主要有：化学标记法（ICAT）和代谢标记法（SILAC）。化学标记法是在提取细胞内总蛋白、经亲和层析后加入同位素标记（体外标记），主要包括酶标记和化学标记两大类。由于同位素“轻”“重”之间存在差异性，采用质谱技术能够方便、简单及快速地区分并鉴定实验组中特异的蛋白质。

2.6其他方法

在mRNA水平的层面进行研究，侧面说明蛋白作用情况。研究基因产物的作用关系是通过刺激细胞检测表达量的变化。Stuart等[13]对人、果蝇及线虫的基因共表达进行了研究，发现了2万多种具有保守性的共表达关系。多维蛋白鉴定技术通过定位蛋白质的亚细胞来研究蛋白质相互作用机制。GST pull-down、Far-western、免疫共沉淀、化学交联等可用于小规模的分析验证试验。

3结束语

高等动物基因组研究人员指出，真正调节生物体复杂性的因素并非基因总量的增长，而是通过更为复杂的蛋白质-蛋白质之间所发生的作用，及其相互影响后形成的生物学作用机制，构建起这些分子间的互动和调控网络，是后基因组时代的首要任务。今后，随着蛋白相互作用的深入研究，以及对蛋白相关靶点的广泛研究，与蛋白相互作用相关的检测技术具有更加广泛的应用前景。

【参考文献】

[1] HU C D，CHINENOV Y，KERPPOLA T K.Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation[J]. Molecular Cell，2002，9（4）：789-798.

[2] WADSWORTH P A，FOLORUNSO O，NGUYEN N，et al. High-throughput screening against protein：protein interaction interfaces reveals anti - cancer therapeutics as potent modulators of the voltage-gated Na+channel complex[J]. Scientific Reports，2019，9（1）：16890.

[3] JIA J， JIN J， CHEN Q， etal.Eukaryotic expression，Co-IP and MS identify BMPR-1B protein-protein interaction network[J].Biological Research，2020，53（1）：24.

[4] KORDIUKOVA M I，POLZIKOV M A，SHISHOVA K V，et al.Identification of the protein partners of the human nucleolar protein SURF6 in HeLa cells by GST pull-down assay[J].Bioorganicheskaia Khimiia，2014，40（4）：421-432.

[5] JAIN A，LIU R J，XIANG Y K，et al.Single-molecule pulldown for studying protein interactions[J].Nature Protocols，2012，7（3）：445-452.

[6] RIGAUT G，SHEVCHENKO A，RUTZ B，et al.A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration[J].Nature Biotechnology，1999，17（10）：1030-1032.

[7] PERTRICOIN E F，ARDEKANI A M，HITT B A，et al.Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet[J].The Lancet，2002，359（9306）：572-577.

[8] STUART J M，SEGAL E，KOLLER D，et al.A gene co-expression network for global discovery of conserved genetic modules[J].Science，2003，302（5643）：249-255.

【作者简介】

通信作者：韩镌竹，女，1985年出生，高级畜牧师，硕士，研究方向为动物源细菌耐药性，261131312@qq.com。

（编辑：于淼）