湖北省地方杏品种资源荧光SSR遗传多样性分析

摘要：为探明湖北省地方杏品种资源的遗传多样性，以湖北省24个地方杏品种为试验材料，采用SSR分子标记结合荧光毛细管电泳技术开展研究。结果表明，来自杏、桃、扁桃和樱桃上的14对引物共扩增出162个多态性等位基因位点，平均每个位点的等位基因数目为11.571。有效等位基因总数为90.312，平均每个位点的有效等位基因数目为6.451。观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、香农指数（I）的平均值分别为0.652、0.813、2.031，多态性信息含量（PIC）平均值为0.794，说明所选近源物种的引物具有较高的通用性，多态性丰富。在相似系数0.580处将24个品种分为3个大组，第1组由洪平杏独立成组，第2组由榔梅、杏梅等4个品种组成，第3组由米杏、五祖杏等19个品种组成。可见，湖北省地方杏品种具有丰富的遗传多样性，采用SSR特异性引物可以鉴别湖北省地方杏品种。

关键词：地方杏；种质资源；荧光SSR标记；遗传多样性；湖北省

中图分类号：S662.2 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）10-0097-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.10.017 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract：To explore the genetic diversity of local apricot variety resources in Hubei Province， 24 local apricot varieties materials were taken as test materials， and SSR molecular markers combined with fluorescence capillary electrophoresis technology were used for the study. The results showed that 14 pairs of primers from apricots， peaches， almonds， and cherries amplified a total of 162 polymorphic effective allele loci， with an average of 11.571 alleles per locus. The total number of effective alleles was 90.312， with an average of 6.451 effective alleles per locus. The average values of observed heterozygosity （Ho）， expected heterozygosity （He）， and Shannon's information index （I） were 0.652， 0.813， and 2.031， respectively. The average value of polymorphic information content （PIC） was 0.794， indicating that the primers for the selected related species had high universality and rich polymorphism. At a similarity coefficient of 0.580， 24 varieties were divided into three large groups. The first group was independently composed of Hongping apricot， the second group consisted of four varieties including Langmei and Xingmei et al， and the third group consisted of 19 varieties including rice apricot and Wuzu apricot. It could be seen that local apricot varieties in Hubei Province had rich genetic diversity， and SSR specific primers could effectively identify Hubei local apricot varieties.

Key words：local apricot； germplasm resources； fluorescent labeled SSR marker； genetic diversity； Hubei Province

杏（Prunus armeniaca L.）属于蔷薇科，在世界范围内广泛种植，它是北半球的重要水果，也是除桃和李之外的第三大硬核水果。在所有的温带水果中，杏在全球产量中排名第七［1］。中国约有2 000个杏的品种和类型，有着悠久的栽培历史，不仅是杏的原产国之一，也是世界上杏种质资源最丰富的国家［2］。普通杏是杏属中品种最多、栽培最广泛、经济价值最高的一个种，它在世界各地的大部分地区种植，主要是在地中海盆地、北美和亚洲，栽培了广泛的品种类型［3］。地方杏资源的遗传多样性研究对中国杏的生产和科研都具有重要意义。

SSR标记，也称为微卫星DNA标记或短串联重复序列标记，是高变DNA元件，由串联重复的单、二、三、四核苷酸或五核苷酸基序组成，它们大量存在于高等生物的基因组中［4］。近些年，SSR标记已在野杏、地方杏和普通杏等中广泛应用［5-9］，具有高水平的多态性、位点特异性、共显性、可重复性、PCR方便、全基因组随机分布等优点［10］。

目前，杏树上主要利用SSR标记进行遗传多样性分析。Hedia等［1］利用25个SSR标记，对从杏栽培地区收集的890份不同杏品种材料进行基因分型，分析了栽培杏的遗传多样性和遗传资源的结构，揭示了该品种在世界范围内的传播历史，证实了杏自中国和中亚的起源。何天明等［11］利用SSR标记进行了新疆栽培杏的群体遗传结构分析；张淑青等［12］利用SSR标记对69个普通杏品种进行了遗传多样性分析；王玉安等［13］利用SSR标记对甘肃地方杏品种资源进行了遗传多样性分析。荧光SSR相对于SSR检测技术，在检测速度和检测效果上都有更明显的优势［14，15］。近年来，荧光SSR标记在果树上得到应用。苑克俊等［15］利用荧光SSR标记构建杏新品系的分子身份证；王璐伟等［16］采用荧光SSR标记对79份桃种质进行遗传多样性分析。这些研究主要是针对普通杏、中国北方的地方杏品种资源。

然而，对湖北省范围内杏种质资源的研究报道较少，本研究旨在对湖北省11个县（市）的 24份地方杏资源进行基于荧光标记的SSR遗传多样性分析，以期为利用中国地方杏品种进行育种改良获得新品种提供指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用24份地方杏资源叶片样本来源于湖北省农业科学院果树茶叶研究所金水试验基地杏资源圃（表1）。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA提取 每份杏种质材料取幼嫩叶片约30 mg，液氮冷冻后研磨，采用改良CTAB法提取叶片基因组DNA，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，用ND-100微量紫外分光光度计（美国Thermo）检测纯度和浓度，稀释至50 mg/L，保存于 -20 ℃冰箱，备用。

1.2.2 SSR引物合成 参考已报道的相关文献，从杏、扁桃、桃、樱桃的引物中合成18对SSR引物，筛选出14对多态性好的引物，序列见表2。由北京擎科生物科技股份有限公司合成。所有F引物的5′端合成修饰引物，可选FAM、HEX、TAMRA、ROX 4种修饰。R引物合成PAGE引物。

1.2.3 PCR反应体系与扩增程序 PCR反应采用20 μL体系：TSINGKE金牌Mix（green）17 μL、正反向引物各1 μL，DNA模板1 μL。

PCR反应程序为：98 ℃预变性2 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共35个循环；72 ℃延伸5 min后4 ℃保存。4种荧光标记体系及扩增程序同上。

1.2.4 电泳及毛细管检测 扩增好的PCR产物zK6CLGZR2vmoJvxbJuYtDw==进行琼脂糖凝胶电泳（2 μL样品+6 μL溴酚蓝），300 V电压下12 min，获取鉴定胶图。通过胶图确定模板浓度，加水稀释到毛细管电泳所需浓度。将分别带有4种荧光标记的PCR产物进行混样，加入LIZ 500内标Marker后在ABI3730XL测序仪进行基因分型。

1.2.5 数据处理 将经ABI3730XL测序仪测序后获得的结果在GeneMapper 4.1软件上进行分析，校正后进行片段大小分析，将读取后的数据录入Excel，进行进一步的分析。对PCR扩增没有结果的样品重复验证该位点有无扩增片段。分析数据按照引物对应关系的核心碱基重复数来确定位点准确大小。每对引物单独分析并得出数据，建立原始数据矩阵。

使用GenALEx软件对24份杏资源样本的观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、香农指数（I）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、无偏期望杂合度（uHe）以及固定系数（F）等多样性指数进行分析。通过PowerMarker软件分析获得多态性信息含量（PIC）数据，基于Nei的遗传距离获得聚类数据，使用MEGA6软件绘制UPGMA树，进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 荧光SSR引物筛选

荧光SSR标记PCR产物经毛细管电泳检测后获得电泳图片和等位基因数据。图1、图2分别为PMS2、ASSR71标记引物在1个杏品种上的扩增产物带型，峰型尖锐锋利，周围有若干小峰，无明显杂峰，说明引物特异性较好，适合杏种质资源的相关研究。参考已报道的相关文献，从杏、扁桃、桃、樱桃的引物中筛选18对引物进行试验，最终获得14对适用于杏种质资源研究的SSR标记引物。

2.2 不同引物的遗传多样性分析

利用14对引物对24份湖北杏种质资源进行DNA扩增，共扩增出162个多态性等位基因位点（Na，表3）。其中，最小的等位基因数目为6.000（ASSR71），最大的等位基因数目为18.000（AMPA105），平均每个位点的等位基因数目为11.571。有效等位基因总数为90.312，数值变化范围在2.887（ASSR71）～11.520（AMPA105），平均每个位点的有效等位基因数目为6.451。有效等位基因数低于观测等位基因数，表明在基因组中存在一些高频率的等位基因。各位点的观测杂合度（Ho）变异幅度在0.417（UDP97-402）～0.833（AMPA112），平均Ho为0.652，期望杂合度（He）在0.654（ASSR71）～0.913（AMPA105），平均He为0.813，说明试验材料具有较高的多态性，分子标记质量较好。香农指数（I）范围在1.302（ASSR71）～2.638（AMPA105），平均值为2.031。多态性信息含量（PIC）数值范围在0.610（ASSR71）～0.907（AMPA105），平均值为0.794，其中所有引物的多态性信息含量均在0.600以上，说明试验使用的引物多态性较高。由以上结果可以看出，所选的标记具有丰富的多态性，能在分子水平上准确反映各品种间的遗传关系，同时也说明24份湖北省地方杏样本在分子水平上具有较高的遗传多样性。

2.3 聚类分析

为了解湖北杏种质资源之间的遗传关系，在PowerMarker中对24份资源的遗传距离进行计算。基于Nei的遗传距离［22］，使用MEGA6软件进行个体的UPGMA树聚类分析（图3）。

根据聚类分析结果，在相似系数0.580处将24份资源分为3组。

第1组由洪平杏独立成组。洪平杏是杏属内一狭域分布种，仅见于神农架林区。关于洪平杏在杏属的分类地位一直有争议，有学者根据形态学推测其可能为梅和杏的天然杂交种，也有学者依据形态研究认为其为梅的一个变种，另有相关形态研究表明其为一个独立的种，但与梅的关系更近。

第2组由榔梅、杏梅、老杏梅、桃李杏4个品种组成。其中榔梅来自丹江口市，杏梅和老杏梅来自钟祥市，桃李杏来自大悟县。丹江口市的榔梅与钟祥市的杏梅没有区分开，疑似同名异物资源。榔梅、杏梅、桃李杏3个品种亲缘关系非常近。

第3组由19个品种组成。来源于巴东县的米杏与黄梅县的五祖杏、大河杏（1）、大河杏（2）聚成小组，大悟县的小麦杏与广水市的中熟杏、秭归县的荷包杏与秭归本地杏（2）聚成小组。

3 小结与讨论

本研究采用荧光SSR分子标记技术分析了湖北省地方杏品种资源的遗传变异和亲缘关系。用14对SSR特异性引物扩增出丰富的多态性条带，显示出所用引物具有较高的鉴别湖北省地方杏品种资源的能力。SSR位点的特征指数数据，如杂合度、香农指数等，揭示了湖北省地方杏品种具有丰富的遗传变异性。本研究结果为进一步分析和利用湖北省杏品种资源提供了理论依据。

目前，SSR荧光标记毛细管电泳技术在杏上已有应用，主要用于种质遗传多样性分析、遗传图谱构建、种质鉴定、亲本分析等方面。但是全世界范围类已开发的杏SSR标记都较少，近源物种的SSR分子标记具有较高的通用性，杏种质资源的研究大多采取近源物种的SSR分子标记。本试验选用的14对引物中，除杏引物3对外，还有近源物种桃引物7对、扁桃引物2对和樱桃引物2对。

14对SSR引物在24份杏种质中共检测到162个等位基因（Na），平均每个位点11.571个；多态信息含量（PIC）为0.610～0.907，均值为0.794，本研究结果表明近缘植物SSR分子标记在杏种质资源中具有较高的通用性，与斯钦毕力格等［8］、张淑青等［12］的研究结论一致。除杏引物外，相对于扁桃、樱桃来说，普通桃SSR引物在杏中的种质多态性最高，适合作为杏种质资源研究的SSR分子标记不足的补充。

聚类分析结果显示，14对引物未能将来自丹江口市的榔梅与钟祥市的杏梅进行有效区分，两份资源是否为同物异名资源，需要进一步研究。同名的小麦杏资源有3份，分别来自钟祥市、大悟县、广水市，根据DNA扩增结果3份资源存在明显差异，说明3份资源为同名异物资源。同名为杏梅的资源有3份，1份来自钟祥市，另外2份来自广水市，根据DNA扩增结果3份资源存在明显差异，说明3份资源为同名异物资源。通过SSR分子标记扩增，有效区分了湖北省的部分同名杏品种，甚至是同一区（县）的同名物种，对湖北省地方同名异种品种的鉴定提供了有效的筛选SSR分子标记。

参考文献：

［1］ HEDIA B，IVAN S，CHRISTOPHER S， et al. Genetic structure of a worldwide germplasm collection of P_{+fTcgAriTUbL5tG1JggT02zRy9cYGMJrUMa/TGm0ODM=}runus armeniaca L. reveals three major diffusion routes for varieties coming from the species’ center of origin［J］. Frontiers in plant science， 2020，11： 1-17.

［2］ 张加延. 全国李与杏资源考察报告［J］. 中国果树，1990（4）：29-34.

［3］ HAGEN L S， CHAIB J， FADY B， et al. Genomic and cDNA microsatellites from apricot （Prunus armeniaca L.）［J］. Molecular ecology notes， 2004， 4： 742-745.

［4］ DIETHARD T. Hypervariabflity of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers［J］. Nucleic acids research， 1989， 17（16）： 6463-6471.

［5］ 刘志琨，陈雪峰，王 端，等. 基于SSR标记的普通杏种质资源遗传多样性分析 ［J/OL］. 分子植物育种， 1-22［2023-07-24］.

［6］ 董胜君，温佳星，卢彩云，等. 野杏经济性状SSR关联分析及优异等位变异挖掘 ［J］. 经济林研究， 2022， 40（2）： 71-82.

［7］ 赵海娟，章秋平，马小雪，等. 杏高通量荧光SSR检测体系及分子身份证的构建 ［J］. 分子植物育种， 2023， 21（24）： 8134-8143.

［8］ 斯钦毕力格，包文泉. 用于杏种质资源遗传多样性分析的SSR引物的筛选 ［J］. 分子植物育种， 2019， 17（5）： 1551-1557.

［9］ 董胜君，王新鑫，张皓凯，等. 基于SSR标记的东北杏遗传多样性分析及指纹图谱构建 ［J］. 沈阳农业大学学报，2021，52（6）： 668-676.

［10］ FORSTER B P，RUSSELL J R， ELLIS R P. Locating genotypes and genes for abiotic stress tolerance in barley： A strategy using maps， markers and the wild species［J］. New Phytol，1997，137：141-147.

［11］ 何天明，陈学森，高疆生，等.新疆栽培杏群体遗传结构的 SSR分析［J］.园艺学报，2006，33（4）：809-812.

［12］ 张淑青，刘冬成，刘威生，等.普通杏品种SSR遗传多样性分析［J］.园艺学报，2010，37（1）：23-30.

［13］ 王玉安，欧巧明，陈建军，等.甘肃地方杏品种资源的SSR遗传多样性分析［J］.西北农业学报，2013，22（3）：98-100.

［14］ 赵海娟，章秋平，马小雪，等. 杏高通量荧光SSR检测体系及分子身份证的构建［J］. 分子植物育种，2023，21（24）： 8134-8143.

［15］ 苑克俊，牛庆霖，葛福荣，等. 利用荧光SSR标记构建杏新品系的分子身份证［J］. 北方园艺， 2018（4）： 34-40.

［16］ 王璐伟，沈志军，李贺欢，等.基于SSR荧光标记的79份桃种质遗传多样性分析［J］.中国农业科学，2022，55（15）：3002-3017.

［17］ IEZZONI A， SCHMIDT H， ALBERTINI A. Cherries （Prunus）［M］. Intl. Soc. Hort. Sci.，Wageningen， The Netherlands，1990.

［18］ CANTINI C，LEZZONI A F，LAMBOY W F， et al. DNA fingerprinting of tetraploid cherry germplasm using simple sequence repeats［J］. Journal of the Americal society for horticultural science， 2001，126（2）：205-209.

［19］ BAO W， WU T， LI T， et al. Genetic diversity and population structure of Prunus mira （Koehne） from the Tibet plateau in China and recommended conservation strategies［J］. PLoS ONE， 2017，12（11）： e0188685.

［20］ DIRLEWANGER E， COSSON P， TAVAUD M， et al. Development of microsatellite markers in peach ［Prunus persica （L.） Batsch］ and their use in genetic diversity analysis in peach and sweet cherry （Prunus avium L.）［J］. Theor Appl Genet， 2002， 105（1）：127-138.

［21］ CIPRIANI G，LOT G， HUANG W G， et al. AC/GT and AG/CT microsatellite repeats in peach （Prunus persica L. Batsch） isolation， characterization and cross-species amplification in Prunus［J］. Theor Appl Genet， 1999， 99（1-2）：65-72.

［22］ MASATOSHI N， FUMIO T， YOSHIO T. Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular data［J］. Journal of molecular evolution， 1983（19）：153-170.

收稿日期：2024-04-16

基金项目：湖北省农业科技创新中心项目（2021-620-000-001-01）；湖北省种业高质量发展专项资金（HBZY2023A001-52）；湖北省农业科技重点课题与平台专项（2021-620-005-003）

作者简介：叶缘铭（1996-），女，湖北孝感人，研究实习员，硕士，主要从事果树资源研究，（电话）18772129249（电子信箱）1376148681@qq.com；通信作者，田 瑞（1978-），男，湖北荆门人，副研究员，硕士，主要从事果树种质资源与遗传育种研究，（电话）027-87770272（电子信箱）79011129@qq.com；蔡 化，（电子信箱）34582248@qq.com。