一种检测家禽配合饲料中蛋白同化激素的高效液相色谱-串联质谱方法

2024-10-31庞李艳次仁玉珍廖柳媚陈粉娜孙洁吴凯唐涛罗国强王丹竹韩银涛张秋韵

国外畜牧学·猪与禽 2024年5期

摘要：本文基于高效液相色谱-串联质谱法建立了一种高精密度检测家禽配合饲料中蛋白同化激素的方法，并对所建立的方法进行了方法学的考察与验证。基于现存研究对前处理步骤进行了优化，并采用高效液相色谱-串联质谱进行分析。睾酮、勃地龙、美雄酮及诺龙的标准曲线相关系数分别为0.997 143、0.999 041、0.994 270、0.999 698，方法检出限分别为2.26、2.29、2.78、2.34 μg/kg，回收率为89.0％～101.3％、87.5％～107.0％、91.0％～107.0％、86.5％～102.0％，相对标准偏差为1.1％～4.1％、3.0％～4.2％、2.7％～4.1％、2.2％～4.3％。结果表明，该方法检出限低，回收率较好，同时精准度高，重复性好，可以为检验家禽配合饲料中蛋白同化激素提供有力的方法支撑。

关键词：蛋白同化激素；高效液相色谱-串联质谱；精密度；回收率

中图分类号：TS252.7 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2024）05-0062-04

蛋白同化激素（anabolic androgenic steroids）是同化类固醇，是雄性化作用减弱而蛋白同化作用增强的甾体激素，主要种类包括睾酮衍生物（睾酮、勃地龙等）、雄烷衍生物（美雄酮、雄烯二酮等）、诺龙衍生物（诺龙、丙酸诺龙等）、杂环衍生物和杂类合成类固醇（美伦孕酮、黄体酮等）五大类[1]。这些物质具有相似的生理功能，但其M/A分化指数（M表示同化作用，A表示雄性激素活性）存在差异，M/A分化指数越高，同化作用相对越强[2]。蛋白同化作用可促进蛋白质合成，减少蛋白质分解，从而使肌肉和体重增加，同时促进钙、磷吸收，加速骨钙化；此外，还可以刺激生成促红细胞生成素，促进血细胞的生成以及加速伤口愈合[3-4]。由于具有以上作用，蛋白同化激素被不法商家非法添加在畜禽饲料中以提高肉类产品的产量，含有这些激素的农产品被人摄入后在体内迁移蓄积，长期食用会导致性功能异常、肝功能障碍、内分泌紊乱，甚至诱发心血管疾病，从而对人体健康产生长远的不良影响[3，5]。因此，检测饲料中蛋白同化激素的含量对保障畜禽产品质量安全、维护人体健康有着重要意义。

目前蛋白同化激素的检测方法主要有高效液相色谱-串联质谱法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）、气谱法、免疫分析法等[6-7]。其中高效液相色谱-串联质谱法结合了色谱的良好分离能力与质谱的高特异性检测特点，可实现对多种物质的同时测定，适用于复杂生物样本的分析检测。然而，使用高效液相色谱-串联质谱法测定饲料中蛋白同化激素的相关研究较少[8-9]。

因此，本研究以家禽配合饲料为样本，建立简便、快速、可重复性高的前处理，采用高效液相色谱-串联质谱法对样本中的睾酮、勃地龙、美雄酮及诺龙这4种蛋白同化激素进行定性定量检测，以期为蛋白同化激素的检测提供有力的技术参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

Aglient 1290超高效液相色谱仪，AB Sciex Triple Quad™ 5500质谱仪，OAN-EVAP 24型全自动氮吹仪，TAITEC Mix-VR多管漩涡混合仪，梅特勒AG285型天平，IKAKS501型旋涡混合器，Sigma 3K15冷冻离心机，Millipor超纯水仪，研磨机。

1.2 试剂

乙腈（色谱纯），甲醇（色谱纯），甲酸（色谱纯），0.1％（体积分数）甲酸溶液。

1.3 样本制备

取适量家禽配合饲料，用组织捣碎机捣碎，放入洁净容器作为试验样本，密封并标记，常温保存。

1.4 标准溶液的配制

称取睾酮、勃地龙、美雄酮及诺龙的标准样本，用甲醇分别配成1 000 μg/mL的标准样本储备液，－20 ℃冰箱中保存，有效期12个月；分别取4种1 000 μg/mL的蛋白同化激素标准样本储备液于同一容量瓶中，用甲醇稀释成100 μg/mL 混合标准溶液，－20 ℃冰箱中保存，有效期 6个月；再取100 μg/mL混合标准溶液稀释为10 μg/mL的混合标准样本工作液。

1.5 样本前处理

称取5.00 g均质试验样本，置于50 mL离心管中，加入5 g碾磨小珠和乙腈20 mL。 10 000 r/min快速碾磨30 s后，6 000 r/min离心10 min，上清液转移至50 mL梨形瓶中，在40 ℃水浴下氮气吹干，用乙腈（含0.1％甲酸）1.0 mL溶解残渣，涡旋45 s后过0.22 μm滤膜，供HPLC-MS/MS分析。

1.6 HPLC-MS/MS条件

1.6.1 高效液相色谱条件

色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流动相A相为0.1％甲酸水溶液；流动相B相为甲醇；色谱柱温度为40 ℃；进样量5.0 μL。梯度洗脱程序见表1。

1.6.2 质谱条件

离子源为电喷雾离子源；扫描方式为负离子扫描；检测方式为多反应监测；电喷雾电压5 500 V；离子源温度600 ℃；气帘气压力为28 psi；碰撞气压力为10 psi；雾化气压力为55 psi；辅助加热气压力为60 psi。

定性离子对、定量离子对、采集时间、去簇电压及碰撞能量见表2。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

按方法条件设置仪器参数，配制一系列浓度的标准样本溶液（1.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL），待仪器参数稳定后，对系列标准样本溶液进行测定，绘制标准曲线。睾酮、勃地龙、美雄酮及诺龙的相关系数为0.997 143、0.999 041、0.994 270、0.999 698，具体见表3。

2.2 方法检出限确定

以空白家禽配合饲料样本为基质，做7个平行添加试验，阳性添加浓度睾酮、勃地龙、美雄酮及诺龙均为20 μg/kg，按照1.5方法进行前处理和上机测定，测得睾酮、勃地龙、美雄酮及诺龙的方法检出限分别为2.26、2.29、2.78、2.34 μg/kg，具体见表3。计算公式如下：

检出限（μg/kg）= K·Sb·C/X

式中：K取3；Sb为平行测试样含量的标准偏差；C表示加标浓度，μg/kg；X指平行试样含量的平均值。

2.3 回收率及精密度确定

以空白家禽配合饲料样本为基质，向家禽配合饲料样本中添加蛋白同化激素（睾酮、勃地龙、美雄酮及诺龙）浓度水平分别为20.0、40.0、200.0 μg/kg进行加标回收试验。按照方法进行前处理，上机测试，结果见表4和表5。

根据表4与表5中相对标准偏差和回收率结果可发现，该方法的相对标准偏差较低，且回收率表现较好，睾酮、勃地龙、美雄酮及诺龙的回收率分别为89.0％～101.3％、87.5％～107.0％、91.0％～107.0％、86.5％～102.0％，相对标准偏差为1.1％～4.1％、3.0％～4.2％、2.7％～4.1％、2.2％～4.3％。该方法的检出限较低、同时重复性较好，并且能保持较为优异的回收率，可用于睾酮、勃地龙、美雄酮及诺龙的准确定性、定量检测。

3 结论

本文旨在建立一种基于高效液相色谱-串联质谱的检测家禽配合饲料中蛋白同化激素简便测定方法，为相关行业检测工作提供该类激素的检测方法及检测技术参考。结果表明，此方法前处理简单，精密度高而且稳定性好，较大地提高了检测效率，适用于家禽配合饲料中睾酮、勃地龙、美雄酮及诺龙残留量的定性、定量检测。

参考文献

[1] 李凯，岑瑛．蛋白同化激素及其应用[J]．现代临床医学，2006，32（4）：306-308.

[2] 刘治军，党国红．蛋白同化激素与竞技运动[J]．临床药物治疗杂志，2008，6（3）：32-34.

[3] 王博，张婧，贡松松，等．高效液相色谱-串联质谱法检测配合饲料中11种蛋白同化激素含量[J]．分析测试学报，2022，41（12）：1779-1784.

[4] 刘娟，刘光晶．蛋白同化激素及其受体在创面愈合中的作用[J]．社区医学杂志，2013，，11（3）：21-23.

[5] 赵健，桂士良，崔腾腾，等．睾酮的生理作用及临床应用进展[J]．中国性科学，2020，29（1）：20-24.

[6] 天津科技大学. 一种用于蛋白同化激素免疫分析的酶标抗原及分析：中国，CN104849476A[P]．化学分析计量，2015，24（5）：61.

[7] 王敬，张海超，贾海涛，等．QuEChERS/高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中14种蛋白同化激素残留[J]．食品工业科技，2022，43（20）：291-299.

[8] 王博，张婧，吴剑平，等．超高效液相色谱-串联质谱测定预混合饲料中11种蛋白同化激素[J]．饲料研究，2023，46（14）：119-124.

[9] 白兆鹏．饲料用油脂中蛋白同化激素检测方法分析[J]．畜牧兽医科技信息，2017（2）：128.