转录组分析低氧胁迫对鲫鳃组织基因表达影响

摘 要：为探究鲫（Carassius auratus）鳃组织对低氧的适应性变化，使用RNA-seq技术对低氧（溶解氧0.6 mg/L±0.2 mg/L，水温16 ℃±0.5 ℃）处理0 h和96 h的鲫的鳃组织进行转录组测序，共获得40.22 Gbp Clean Base，每个样本93%～96%的碱基质量值大于Q30。差异分析共获得7 142个差异基因（| log2FoldChange |≥1且FDR＜0.05）。GO功能富集分析表明，差异表达基因主要在DNA复制启动、MCM复合体等功能显著富集。KEGG通路富集分析表明，差异基因主要在DNA复制、VEGF信号通路、坏死型凋亡等通路中被显著富集。综上所述，vegf、vegfb、hba、hbb、mcm2—mcm6、ripk3等基因是鲫96 h低氧适应的关键基因。

关键词：鲫（Carassius auratus）；低氧胁迫；转录组

基金项目：国家自然科学基金项目（32303030）；河北省自然科学基金（C2021204089；V1654588161890；236Z6701G）；河北农业大学人才引进科研基金（YJ2020032）；河北省现代农业产业技术体系淡水养殖创新团队名优特种类繁育及绿色高效养殖（HBCT2023230205）。

作者简介：侯智广（2000-），男，硕士研究生，研究方向：鱼类遗传育种。E-mail：hzg66888@sina.com。

通讯作者：吴成宾（1988-），男，副教授，研究方向：鱼类遗传育种。E-mail： hyxywcb@hebau.edu.cn。

DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2024.10.004

鲫（Carassius auratus）隶属于鲤形目（Cypriniformes），鲤科（Cyprinidae），是一种广泛分布于江河、湖泊、水库、池塘等大小水体中的鱼类，主要栖息于水域的中下层，具有极强的耐低氧能力，当含氧量低达0.1 mg/L时，开始死亡。当水体中溶解氧（DO）小于2 mg/L 时，被认为处于低氧状态。氧气是影响鱼类活动的重要因素之一，是鱼类生存的基础。当水体中的溶解氧下降时，会引起鱼类摄食量减少、生长速度减慢、免疫力降低、生殖力下降，甚至死亡。水体中的溶解氧易受到外界因素的影响，如气候变暖、水体富营养化、浮游动物呼吸等，鱼类为了适应低氧环境，在其生理状态和行为上也会发生相应的改变，例如增加呼吸频率、到达水面呼吸、增强血氧亲和力等。

鲫在缺氧状态下还会发生鳃重塑。有学者研究发现，在低氧状态下鲫鳃丝上皮细胞变薄，且有明显突出的鳃小片和 7.5 倍大的鳃表面积，进而增加氧气交换效率。重塑过程中涉及到鳃小片间细胞（ILCM）的增殖与凋亡，某些细胞可能会增殖以形成新的鳃丝结构，而一些老化的或不再需要的细胞则可能会凋亡。这可能是鲫耐低氧的原因之一。当水中溶解氧水平发生变化时，鱼类某些与氧感应相关基因的表达（hif-α、phd2、vhl和fih-1）也会发生变化。本研究运用转录组学相关技术，对鲫鳃组织进行转录测序，分析低氧胁迫下鳃组织基因转录水平的变化，探究调控鲫低氧适应的功能基因，旨在为探究鱼类耐低氧适应机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验设计

本课题使用的鲫取自河北省张家口市。取鲫30尾（体质量：225 g±25 g，体长：18～21 cm），随机平分为3缸（即每缸10尾，水体150 L，水温16 ℃±0.5 ℃，溶解氧＞6 mg/L），置于室内水体中暂养。7 d后开始低氧处理，使用玻璃板封闭水体表面，采用空气和氮气混合充气的方法使鱼缸内溶解氧保持在（0.6±0.2）mg/L，水温（16±0.5）℃，低氧处理96 h。鲫鳃样本取自常氧0 h（C_0）和低氧96 h（T_96）。解剖前用MS-222将鱼麻醉，立即收集第二片鱼鳃样本，冷冻在液氮中并储存在-80 ℃下直至RNA测序。

1.2 分析方法

将采集的鳃组织样品送至天津诺禾致源生物信息科技有限公司进行高通量测序。测序完成后，使用fastp对下机Raw Data（原始数据）进行质控、去除接头，得到Clean Data（过滤后数据）。在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载参考基因组（GCF_003368295.1），使用HISAT2构建索引，并将Clean Data映射到参照基因组。featureCounts用于计算映射到每个基因的读数。使用DESeq2进行差异基因分析，通过以下阈值进行识别：| log2FoldChange |≥1且FDR＜0.05 ，被认为是显著差异基因。使用clusterProfiler将所有的差异基因映射到GO数据库 （http：//geneontology.org/）和KEGG数据库（https：//www.genome.jp/kegg/）进行富集分析，P＜0.05被认为显著富集，ggplot2进行可视化。

1.3 荧光定量PCR验证

按照制造商的方案使用TRIzol法提取鳃组织的总RNA，使用核酸蛋白检测仪检测RNA的纯度和浓度，随后反转录PCR（reverse transcription-PCR， RT-PCR）合成cDNA。使用NCBI-BLAST在线设计引物（表1）。以cDNA为模板，18S rRNA为内参基因，选取6个关键差异表达基因使用荧光定量PCR仪（Bio-Rad CFX96）进行实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR， qRT-PCR）验证，反应程序：95 ℃预变性30 s，然后 95 ℃变性10 s、60 ℃退火30 s（39个循环），65 ℃延伸5 s。采用2-ΔΔCt值计算每个基因的相对表达量。

1.4 数据分析

试验结果用平均值±标准差（Mean±SD）表示。P＜0.05为显著，P＜0.01为极显著。

2 结果

2.1 转录组测序结果

对两组鲫鳃组织样品测序共获得40.22 Gbp Clean Base（过滤后有效数据量），Q20碱基在97%～98%，Q30碱基在93%～96%，GC含量在42%～46%，转录组测序质量较好，测序数据符合后续的基因功能分析和注释要求（表2）。

2.2 差异表达基因

通过对常氧组和低氧组基因进行差异分析，按差异倍数（FoldChange≥2）和校正后的P值（FDR＜0.05）筛选，共得到7 142个差异表达基因，包括3 146个下调基因和3 996个上调基因（封二图1）。

2.3 KEGG和GO富集

KEGG富集分析（封二图2）共得到26条显著富集通路（P＜0.05）。包括DNA复制（caua03030）、甘油磷脂代谢（caua00564）、坏死性凋亡（caua04217）、VEGF信号传导通路（caua04370）、ErbB信号通路（caua04012）、胞质DNA感应通路（caua04623）和胞葬作用（caua04148）等。

GO富集分析显示（封二图3），差异基因富集到3个功能类别：生物过程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）和细胞成分（Cellular Component，CC），显著富集到的条目共33个（P＜0.05）。在生物过程类别中，富集到DNA 复制启动（GO∶0006270）、染色体组织（GO∶0051276）、DNA 复制（GO∶0006260）、激活免疫应答（GO∶0002253）等。在分子功能类别中，富集到高尔基体（GO∶0005794）、微染色体维持复合体（GO∶0042555）等。在细胞成分类别中，富集到ATP水解活性（GO∶0016887）、氨基酰基转移酶活性（GO∶0016755）等。

2.4 功能基因表达量验证

利用qRT-PCR验证6个差异基因的表达情况，发现差异基因qRT-PCR结果与转录组测序结果具有相似的表达趋势（封二图4），表明本研究中的转录组数据的可靠性。

3 讨论与分析

Wang等在低氧诱导的细胞核提取物中发现了HIF。大量的研究表明低氧诱导因子1（hypoxia- inducible factors 1，HIF-1）蛋白在生物体低氧适应时起着重要作用。低氧胁迫下花鲈、花斑裸鲤、团头鲂的hif-1α基因表达显著上调。在本研究中鲫低氧96 h后hif-1α基因没有显著上调。Sollid等研究发现这可能由于鲫在常氧下动脉血氧分压就保持在较低的水平且Hif-1α蛋白含量存在较高的水平，是hif-1α基因在低氧时保持稳定的原因，Hif-1α蛋白的含量与鲫体重相关，这表明hif-1α基因的表达可能与鲫生理学缺氧无关。

KEGG富集分析发现DNA复制、VEGF信号传导通路和甘油磷脂代谢显著富集，该通路与细胞的增殖、血管内皮生长和细胞膜的通透性相关，vegf、vegfb等基因具有促进内皮增殖、血管生成、血管通透性增加的作用。缺氧为导致vegf基因高表达的因素之一。vegf通过影响血浆酶原活化因子（PA）和血浆酶原活化因子抑制因子-l（PAI-1）的表达，来提高血浆酶原活化因子的活性，促进细胞外蛋白水解，从而增强毛细血管的形成，这表明在96 h时鲫可能通过促进血管的生成和血管通透性增加适应低氧环境。Lu等研究发现在低氧诱导的红鳍东方鲀中与血管生成相关基因也显著上调。血管中的红细胞是脊椎动物运输氧气的主要媒介，本研究发现与血红蛋白生成相关的hba、hbb、hbbe基因表达显著上调，而血红蛋白是红细胞内运输氧气的特殊蛋白，该蛋白的增加提高了红细胞携带氧的能力，这可能是鲫对低氧适应的表现。张曦等研究发现鲫幼鱼急性低氧处理后血液中红细胞数、血红蛋白浓度增加。此外，本研究发现坏死性凋亡和胞葬作用也被显著富集，坏死性凋亡是当细胞凋亡受阻时，通过细胞外信号或细胞内信号被激活的细胞自我破坏的过程，mlkl、ripk3和ripk1基因在此过程中起着主要作用。这表明低氧胁迫过程中存在细胞的凋亡和清除，凋亡的细胞可能是鳃小片间细胞，巨噬细胞通过胞葬作用对其凋亡细胞进行清除，gulp1基因编码的蛋白是吞噬细胞吞噬凋亡细胞的衔接蛋白，低氧96 h时显著上调。

GO富集发现差异基因显著富集到DNA复制启动、DNA复制、MCM复合物等功能，其中mcm2—mcm6基因显著下调，微小染色体维持蛋白（Minichromosome maintenance proteins，MCM）是DNA复制启动和延伸所必需的复制解旋酶，被称为“复制许可证”的复制前复合物，是细胞进入DNA合成期和分裂期的前提，这可能与鳃重塑过程中鳃小片间细胞的增殖受到抑制有关。

4 结论

通过对鲫鳃组织进行转录组分析发现，hif-1α基因的表达可能与鲫生理学缺氧无关，VEGF信号传导通路、DNA复制为96 h时鲫低氧适应的主要通路。其血管生成、血红蛋白、细胞膜通透性增加和鳃小片间细胞的增殖受抑制可能在鲫低氧96 h时起主要作用，vegf、vegfb、hba、hbb、mcm2—mcm6、ripk3等基因是鲫低氧96 h的关键基因。本研究为探索鲫低氧适应的方式和相关功能基因表达的变化提供一定的参考。

参考文献：

饶发祥. 鲫鱼种类生物学特性及其特殊的繁殖方式.北京水产， 1996（Z1）： 21-23.

ZHANG Z，WELLS M C，BOSWELL M G，et al. Identification of robust hypoxia biomarker candidates from fin of medaka （Oryzias latipes）.Comp. Biochem. Physiol.2012，155：11-17.

ABDEL-TAWWAB M， MONIER M N， HOSEINIFAR S H， et al. Fish response to hypoxia stress： growth， physiological， and immunological biomarkers.Fish Physiol.Biochem.2019，45：997-1013.

WU R S，ZHOU B S，RANDALL D J，et al.Aquatic hypoxia is an disrupter and impairs fish reproduction.Environmental Science & Technology，2003，37（6）：1137-1141.

LEVIN L A， BREITBURG D L.Linking coasts and seas to address ocean deoxygenation.Nat Clim Chang，2015，5（5）：401-403.

SAHA N， KONER D， SHARMA R.Environmental hypoxia： A threat to the gonadal development and reproduction in bony fishes.Aquaculture and Fisheries，2022，7（5）;572-582.

DHILLON R S， YAO L， MATEY V， et al.Interspecific differences in hypoxia-induced gill remodeling in carp.Physiological and Biochemical Zoology，2013，86（6）：727-739.

SILKIN Y A，SILKINA E N. Effect of hypoxia on physiological biochemical blood parameters in some marine fish.Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology，2005，41：527-532．

SOLLID J， DE ANGELIS P， GUNDERSEN K， et al.Hypoxia induces adaptive and reversible gross morphological changesin crucian carp gills.The Journal of Experimental Biology，2003，206：3667-3673．

郭志雄.低氧环境对军曹鱼幼鱼生化指标、相关基因表达的影响及其转录组学分析.湛江：广东海洋大学，2020.

PEI X Y， CHU M X， TANG P， et al.Effects of acute hypoxia and reoxygenation on oxygen sensors， respiratory metabolism， oxidative stress， and apoptosis in hybrid yellow catfish "Huangyou-1".Fish physiology and biochemistry，2021，47（5）：1429 -1448

WANG G L， SEMENZA G L.Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1.Journal of Biological Chemistry，1995，270（3）：1230-1237.

张凯强，常志成，温海深，等.花鲈低氧诱导因子基因（hifs）的序列分析及低氧诱导表达.中国海洋大学学报（自然科学版）， 2020， 50 （1）： 39-47.

赵永丽.花斑裸鲤低氧胁迫转录组学及其主要差异基因表达调控研究.西宁：青海大学，2018.

WU C， ZHENG G， ZHAO X， et al.Hypoxia tolerance in a selectively bred F 4 population of blunt snout bream （Megalobrama amblycephala） under hypoxic stress.Aquaculture， 2020， 518：734484-734484.

SOLLID J， RISSANEN E，TRANBERG H K，et al.HIF-1ɑ and iNOS levels in crucian carp gills during hypoxia-induced transformation.Journal of Comparative Physiology B，2006，176：359-369.

刘晓扬，吕婷，杨光路.血管内皮生长因子（VEGF）与神经系统疾病相关性研究进展.临床医学进展， 2021， 11（2）： 821-825.

SHWEIKI D， ITIN A， SOFFER D， et al.Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis . Nature，1992，359（6398）：843-845.

LU Y， LI Y， BAO M，et al.Comparative transcriptome profiling and functional analysis in the blood of tiger puffer （Takifugu rubripes） in response to acute hypoxia.Aquaculture Reports，2023，30：101618.

张曦，付世建，彭姜岚，等.急性低氧对鲫鱼幼鱼血液基础指标的影响.重庆师范大学学报（自然科学版），2011，28（4）：19-22.

WAHLER A， BEYER A S， KELLER I E， et al. Engulfment adaptor phosphotyrosine-binding- domain-containing 1 （GULP1） is a nucleocytoplasmic shuttling protein and is transactivationally active together with low-density lipoprotein receptor-related protein 1 （LRP1）.Biochem J，2013，450（2）：333-343.

TODOROV I T， PEPPERKOK R， PHILIPOVA R N， et al. A human nuclear protein with sequence homology to a family of early S phase proteins is required for entry into S phase and for cell division.J Cell Sci，1994，107：253-65.

Transcriptome analysis of the effects of hypoxic stress on gene expressi on in gill tissues of crucian carp

HOU Zhiguang1， CHEN Li2， XING Mengchao1，CHANG Ruize1， WU Chengbin1

（1.Ocean College of Hebei Agricalture University， Qinhuangdao 066000， China；2. Hebei Academy of Marine and Fishery Sciences， Qinhuangdao 066003， China）

Abstract：In order to investigate the adaptive changes of crucian carp （Carassius auratus） to hypoxia， gill tissues treated with hypoxia （dissolved oxygen 0.6 mg/L±0.2 mg/L， water temperature 16 ℃±0.5 ℃） for 0 h and 96 h and were subjected to transcriptome sequencing by RNA-seq， and a total of 40.22 Gbp Clean Base was obtained， and 93%～96% of bases in each sample had a mass value greater than Q30. Differential analysis yielded a total of 7 142 differential genes （| log2FoldChange |≥1 and FDR＜0.05）. GO functional enrichment analysis showed that the differentially expressed genes were significantly enriched mainly in DNA replication initiation， MCM complex， etc. KEGG pathway enrichment analysis showed that the differentially expressed genes were mainly in DNA replication， VEGF signaling pathway， necrotic apoptosis and other functions. In summary， vegf， vegfb， hba， hbb， mcm2—mcm6， ripk3 and other genes are the key genes for 96 h hypoxia adaptation in crucian carp.

Key words：Carassius auratus;hypoxic;RNA-seq

（收稿日期：2024-07-12）