宏基因组二代测序对肺部感染分枝杆菌的诊断价值

［摘要］目的探讨肺泡灌洗液（BALF）行宏基因组二代测序技术（mNGS）检测在肺部感染病人分枝杆菌诊断中的应用价值。

方法回顾性分析2021年10月—2023年4月在青岛大学附属医院呼吸科因肺部感染住院的281例病人临床资料和BALF病原体检出情况。

结果281例BALF样本的检测阳性率为95.02%。共检测出105种微生物，其中副流感嗜血杆菌（45.20%）是最常见的检出菌种，其次为肺炎链球菌（44.48%）和假肺炎链球菌（32.38%）；检测出分枝杆菌63例，总阳性率为22.42%，其中结核分枝杆菌复合群（MTBC）38例，鸟-胞分枝杆菌复合群（MAC）22例，堪萨斯分枝杆菌、慢生黄分枝杆菌和脓肿分枝杆菌各1例。MTBC的检测结果因年龄而异（χ2=10.992，P＜0.05）；在MAC的检测中，性别差异明显（χ2=9.483，P＜0.01）。在MTBC和MAC分枝杆菌复合群阳性病人中，检测到的合并感染类型存在差异（χ2=9.222，P＜0.05）。

结论mNGS可以提供快速的病原学诊断，在分枝杆菌的诊断方面具有潜力，有助于精准治疗。

［关键词］呼吸道感染；病原；分枝杆菌感染；全基因组测序；支气管肺泡灌洗液

［中图分类号］R517.9;R446.5

［文献标志码］A

［文章编号］2096-5532（2024）04-0591-04doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.85922818b6314448eb8e58cbc22a54e8124

［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［网络出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240829.1446.005;2024-08-3017：30：58

Value of metagenomic next-generation sequencing in the diagnosis of pulmonary mycobacterial infections

QI Yan， LI Chuan， CAO Yiwei， CUI Shichao， XIAO Baohong， LIN Cunzhi

（Department of Tuberculosis Medicine， Qingdao Chest Hospital， Qingdao 266043， China）

; ［Abstract］ObjectiveTo investigate the application value of metagenomic next-generation sequencing （mNGS） of bronchoalveolar lavage fluid （BALF） in the diagnosis of mycobacteria in patients with pulmonary infections.

MethodsA retrospective analysis was performed for the clinical data and BALF pathogen detection results of 281 patients with pulmonary infection who were admitted to Department of Respiratory Medicine， The Affiliated Hospital of Qingdao University， from October 2021 to April 2023.

ResultsThe positive detection rate was 95.02% for the 281 BALF specimens. A total of 105 microorganisms were detected， among which Haemophilus influenzae （45.20%） was the most common bacterial pathogen， followed by Streptococcus pneumoniae （44.48%） and Streptococcus pseudopneumoniae （32.38%）. Mycobacteria was detected in 63 specimens， with a total positive rate of 22.42%， among which there were 38 specimens of Mycobacterium tuberculosis complex （MTBC）， 22 specimens of Mycobacterium avium complex （MAC）， and one specimen each of Mycobacterium kansasii，Mycobacterium lentiflavum， and Mycobacterium abscessus. The results of MTBC detection varied across ages （χ2=10.992，P<0.05）， and a significant gender difference was observed in MAC detection （χ2=9.483，P<0.01）. A significant difference in the type of co-infection was observed between the patients with positive MTBC and those with positive MAC （χ2=9.222，P <0.05）.

ConclusionThe mNGS technique can provide rapid pathogenic diagnosis and facilitate the diagnosis of mycobacteria and precise treatment.

［Key words］respiratory tract infections; noxae; mycobacterium infections; whole genome sequencing; bronchoalveolar la-

vage fluid

呼吸道感染因其高发病率、高病死率和高负担[1-2]，仍是临床医生亟需解决的难题之一。虽然大多数地区的年龄标准化发病率、病死率和残疾调整生命年率都有所下降[3]，但肺部感染仍是第四大死亡原因[4]。不同年龄组病人的主要致病菌各不相同，通常还伴有病毒和（或）真菌感染[5]。尽早明确病原体，为病人争取更及时、更准确的治疗至关重要。目前，临床一般将痰或肺泡灌洗液（BALF）培养作为诊断肺部感染病原体的“金标准”，其他常规诊断方法包括涂片镜检、血清学和PCR等[6-7]，其缺点是培养周期长、覆盖种类有限，尤其是分枝杆菌培养，不能满足临床快速、精准诊断的需要。宏基因组二代测序技术（mNGS）在明确肺部感染性疾病病原体方面具有较高的快速性和灵敏度，可以帮助临床医生及早准确识别病原体，明确临床诊断，并进行及时而准确的治疗[8-9]。本研究回顾性分析281例住院肺部感染病人的临床资料，并对病人的BALF进行mNGS检测，探讨 mNGS 在肺部感染病原体（尤其是分枝杆菌）诊断中的应用价值。

1资料与方法

1.1研究对象

以2021年10月—2023年4月在青岛大学附属医院呼吸与危重症医学科住院治疗的281例肺部感染病人为研究对象，其中男性165例（58.72%），女性116例（41.28%），平均年龄（58.15±13.86）岁。

1.2BALF的采集与mNGS检测

对需要明确病原体的肺部感染病人进行电子支气管镜检查。在局部麻醉或舒适镇静的情况下，将电子支气管镜送入病变所在的支气管肺段或肺亚段，采用防污染灌洗管在室温下用无菌生理盐水多次灌洗，灌洗液总量为80～100 mL，充分吸出，留取BALF约50 mL放入无菌采样管中送检，由南京迪飞医学科技有限公司完成mNGS检测。

1.3检测方法

将按照标准采集的BALF进行mNGS检测，经DNA核酸提取、文库构建和上机测序后，对所得到的原始数据进行质控，与人类基因组序列比对；保留未匹配到的序列，与数据库中的微生物特异性序列进行进一步比对。最终报告结合病人的临床表现，确定肺部感染的病原体。

1.4统计学分析

采用SPSS 26.0软件进行数据统计分析。计数资料以例数和百分数表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1微生物总检出情况

从281例BALF标本中共检出微生物105种，总阳性率为95.02%（267/281）。共检出细菌63种，占检出总数的60.0%，检出前3位的分别为副流感嗜血杆菌（127例，45.20%）、肺炎链球菌（125例，44.48%）和假肺炎链球菌（91例，32.38%），其他依次为流感嗜血杆菌（47例）、铜绿假单胞菌（41例）、结核分枝杆菌复合群（MTBC，38例）、金黄色葡萄球菌（34例）、大芬戈尔德菌（30例）、肺炎克雷伯菌（24例）、纹带棒状杆菌（19例）、鲍曼不动杆菌复合群（19例）和其他（171例）。共检出19种病毒，占检出总数的18.10%，检出前3位的分别为EB病毒（59例，21.00%）、人巨细胞病毒（40例，14.23%）和人疱疹病毒7（30例，10.68%），其他依次为人疱疹病毒1（18例）、人疱疹病毒6B（14例）和其他（28例）。共检出真菌17种，占检出总数的16.19%，包括曲霉菌（38例，13.52%）、白色念珠菌（29例，10.32%）、耶氏肺孢子菌（9例）、近平滑念珠菌（7例）、黑曲霉菌（5例）、黄曲霉菌（4例）和其他（18例）。总共检出6种非典型病原体，占检出总数的5.71%，包括惠普尔养障体11例（3.91%）、肺炎支原体8例（2.85%）、解脲脲原体2例、唾液支原体2例、微小脲原体和鹦鹉热衣原体各1例。

2.2分枝杆菌检出情况

在全部281例BALF样本中，检出MTBC 38例，鸟-胞分枝杆菌复合群（MAC）22例，堪萨斯分枝杆菌、慢生黄分枝杆菌和脓肿分枝杆菌各1例。男性和女性病人的结核分枝杆菌检出率分别为8.90%和4.63%，差异无统计学意义（P＞0.05）；女性病人MAC检出率（6.05%）明显高于男性病人（1.78%），差异有统计学意义（χ2=9.483，P＜0.01）。63例分枝杆菌阳性病人中，痰或BALF抗酸染色阳性8例。见表1。

2.3分枝杆菌合并病毒和真菌检出情况

在MTBC阳性病人中，36.84%（14/38）的病人仅检出病毒，5.26%（2/38）的病人仅检出真菌；而在MAC阳性病人中，9.09%（2/22）的病人仅检出病毒，27.26%（6/22）的病人仅检出真菌。两组合并病毒和真菌检出情况差异有统计学意义（χ2=9.222，P＜0.05）。见表2。

2.4不同年龄组分枝杆菌检出情况

在MTBC检测中，65岁以上人群的阳性率最高（4.98%），36～50岁组最低（1.78%），不同年龄组MTBC的检出率差异有统计学意义（χ2=10.992，P＜0.05）。在MAC检测中，随着病人年龄的增加，阳性率基本呈上升趋势，其中51～65岁组阳性率最高（3.56%），但总体差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

3讨论

随着对病原体检测技术的进步，mNGS在各种感染性疾病中的应用目前受到了广泛的关注和认可[10-11]。mNGS检测具有较高的灵敏度，可以帮助临床医生早期准确识别病原体，并为疾病精准治疗提供依据[12-14]。本研究纳入的281例肺部感染病人的BALF样本中，共检测到105种微生物，阳性率为95.02%，细菌检出率最高的是副流感嗜血杆菌，其次为肺炎链球菌、假肺炎链球菌。这些细菌可以有条件地定植在呼吸道或鼻咽部[15]，需要结合病人的病史、临床症状等检查综合判断是否为致病性细菌[16]。除这些细菌外，检出率前5位的细菌分别为铜绿假单胞菌、MTBC、金黄色葡萄球菌、大芬戈尔德菌和肺炎克雷伯菌，与LIU等[5]的研究结果基本一致。在病毒检测中，EB病毒、人巨细胞病毒和人类疱疹病毒7的检出率超过10%，感染这些病毒后的症状通常因病人的年龄和免疫状态而异[17-18]，这些病毒在健康人群中定植，当免疫力低下时重新激活，导致呼吸道疾病。真菌中主要检出曲霉菌、念珠菌和日本肺孢子菌，这些真菌是肺部侵袭性真菌感染的主要病原体[19-22]。

本研究所有样本分枝杆菌检测中，MTBC的检出率最高，其次是MAC。不同性别间MAC的检出率差异有统计学意义，但在MTBC中差异无统计学意义。推测检出率的差异可能与男性病人的吸烟习惯有关，吸烟会损害人体对结核分枝杆菌的肺部免疫[23-24]。然而，女性病人的MAC检出率明显高于男性病人，与文献报道相一致[25]。本研究通过分析发现，MTBC和MAC阳性病人在合并病毒和真菌感染方面存在统计学差异，MAC更有可能合并真菌感染，而MTBC更有可能合并病毒感染。不同年龄组的分枝杆菌检出率也不尽相同，其中MTBC的检出率不同年龄组差异有统计学意义，约70%的感染者年龄在50岁以上，与FERNANDES等[26]的研究结果相一致。

mNGS在判断罕见或难以培养的病原菌感染方面具有突出优势。XIE等[27]研究表明，mNGS是肺炎诊断的重要工具，有助于指导个体化治疗，减少早期未明确病原体时经验性用药所致的耐药性。此外，对于分枝杆菌、病毒和支原体等，传统的分离培养条件苛刻且耗时长[28]，阳性率低；PCR或病毒抗体检测等方法则需要预测病人的病情[29]；而mNGS可以提取和比对病变样本中所有微生物的遗传信息，不仅可以尽早区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，还可以提高检测时效性和灵敏度[30-33]。然而，mNGS也有其局限性，检测结果复杂，目前仍缺乏公认的解释标准，仍需结合传统检测结果分析。

综上所述，mNGS检测可以提高肺部感染病人BALF样本的病原学阳性率，与常规方法相结合，可为临床病例分枝杆菌、病毒和真菌的精准诊断提供指导。

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（本文编辑牛兆山）