TLR4基因多态性与小儿反复呼吸道感染的关系

［摘要］目的探究Toll样受体4（TLR4）基因多态性与小儿反复呼吸道感染（RRTI）的关系。

方法选择107例RRTI病儿作为观察组，另选103例体检健康儿童作为对照组（近1年未出现RRTI），采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术分析两组TLR4基因rs2737190位点多态性，比较不同病情严重程度病儿TLR4基因多态性的差异，并分析不同TLR4基因多态性病儿临床特征的差异。

结果观察组TLR4基因rs2737190位点AG基因型、G等位基因频率均明显高于对照组，AA基因型频率明显低于对照组（χ2=4.129～8.564，P<0.05）；中重度RRTI病儿GG基因型、G等位基因频率明显高于轻度病儿，AA基因型频率显著低于轻度病儿（χ2=9.233～13.357，P<0.05）；AA基因型病儿年发作次数、合并呼吸困难比例，以及C反应蛋白、白细胞介素-6、γ-干扰素和丙二醛等指标均显著低于AG和GG基因型病儿，超氧化物歧化酶则显著高于AG和GG基因型病儿（χ2=7.573，F=4.668～24.317，P<0.05）。

结论TLR4基因 rs2737190位点AG基因型、G等位基因频率会增加小儿RRTI易感性，并促进其炎症反应升高和病情进展。

［关键词］呼吸道感染；再感染；儿童；Toll样受体4；多态性，限制性片段长度；病人病情

［中图分类号］R517.6;R392.1

［文献标志码］A

［文章编号］2096-5532（2024）04-0587-04doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.114

［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［网络出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.r.20240829.1446.006;2024-09-0211：50：26

Association of Toll-like receptor 4 gene polymorphism with recurrent respiratory tract infection in children

ZHAO Shujing， MA Zhiping， ZHANG Jinbiao， FU Feng， FENG Nana

（First Division of Pediatric Department， Cangzhou Hospital of Integrated TCM-WM， Cangzhou 061000， China）

; ［Abstract］ObjectiveTo investigate the association of Toll-like receptor 4 （TLR4） gene polymorphism with recurrent respiratory tract infection （RRTI） in children.

MethodsA total of 107 children with RRTI were enrolled as RRTI group， and 103 children who underwent physical examination and did not experience RRTI in the past year were enrolled control group. Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism was used to analyze the rs2737190 polymorphism of the TLR4 gene in each group. TLR4 gene polymorphism was compared between children with different severities， and clinical features were compared between children with different TLR4 gene polymorphisms.

ResultsCompared with the control group， the observation group had significantly higher frequencies of AG genotype and G allele and a significantly lower frequency of AA genotype at TLR4 rs2737190 locus （χ2=4.129-8.564，P<0.05）. Compared with the children with mild RRTI， the children with moderate-to-severe RRTI had significantly higher frequencies of GG genotype and G allele and a significantly lower frequency of AA genotype （χ2=9.233-13.357，P<0.05）. Compared with the children with AG genotype or GG genotype， the children with AA genotype had significantly lower number of annual attacks and proportion of children with dyspnea， significantly lower serum levels of C-reactive protein， interleukin-6， interferon-γ， and malondialdehyde， and a significantly higher level of superoxide dismutase （χ2=7.573，F=4.668-24.317， P<0.05）.

ConclusionThe frequency of AG genotype and G allele at TLR4 rs2737190 locus may increase the susceptibility to RRTI and promote inflammation response and disease progression in children.

［Key words］respiratory tract infections; reinfection; child; Toll-like receptor 4; polymorphism， restriction fragment length; patient acuity

反复呼吸道感染（RRTI）可反复发作且病因较为复杂，若未及时进行有效治疗，容易出现多种并发症[1-2]。此外，RRTI在长期反复治疗过程中药物对肝损伤风险也大。相关研究结果显示，不同个体之间疾病易感性和临床表现多样与单核苷酸基因多态性（SNP）密切相关[3]。Toll样受体4（TLR4）作为TLRs家族成员，是一种能通过识别病原微生物的跨膜蛋白来抑制病原体侵袭的炎症激活蛋白[4]，目前已经发现其基因多态性与哮喘[5]、慢性阻塞性肺疾病[6]、肺癌[7]等多种呼吸系统疾病有关，但关于它与RRTI关系的研究并不多见。本研究采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术检测RRTI病儿TLR4基因多态性并探讨二者的关系，旨在为临床治疗RRTI提供新的靶点和方向。

1对象与方法

1.1研究对象

选取2022年1月—2023年4月河北省沧州中西医结合医院收治的107例RRTI病儿作为观察组，另选103例同期体检健康儿童作为对照组（近1年未出现RRTI）。纳入标准：①RRTI符合《儿童反复呼吸道感染临床诊疗路径（2022版）》[8]的诊断标准；②年龄3～12周岁；③采血前4周内未使用抗感染药物、免疫抑制剂或糖皮质激素等治疗；④病儿家长签署知情同意书。排除标准：①入组前已经存在惊厥；②合并先天性呼吸系统畸形、先天性心脏病；③合并颅内感染、脑血管病者；④合并免疫系统疾病、血液系统疾病、肝肾脾等重要脏器功能障碍。两组性别、年龄、体质量指数（BMI）、贫血史等一般资料比较差异均无显著性（P>0.05），具有可比性。见表1。本研究经医院医学伦理委员会审核通过。

1.2研究方法

1.2.1TLR4基因rs2737190位点PCR-RFLP测定采集受试者外周静脉血（EDTA抗凝）2 mL，使用DNA提取试剂盒提取外周血DNA，并以其作为模板进行PCR扩增反应。扩增反应参数：94 ℃、10 min，94 ℃、30 s，64 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共40个循环。扩增产物采用内切酶进行处理，然后进行琼脂糖凝胶电泳。在SNP基因库中查询到TLR4-2381A/G位点引物序列（上游5′-TGGAAAATC-

ACCGTCATCCT-3′，下游5′-GCTGCCTCTAGTGCCCTGTA-3′）。采用Primier 5.0软件设计引物，并委托北京擎科生物公司合成引物，采用美国ABI公司3730XL型基因测序仪进行测序分型。

1.2.2TLR4基因rs2737190位点多态性与病情及临床特征关系病儿入院后采集空腹静脉血4 mL，采用血细胞计数仪进行白细胞（WBC）计数，ELISA法检测C反应蛋白（CRP）、白细胞介素-6（IL-6）、γ-干扰素（IFN-γ）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）等指标，所有操作均按照试剂盒（上海酶联免疫生物公司）说明书步骤进行。将RRTI病儿按肺部感染严重程度分为轻度组和中重度组，比较两组TLR4基因rs2737190位点基因型分布特征。并统计分析不同基因型病儿性别、年龄、病程、家族史、年发作次数、合并呼吸困难、入院后体温，以及血常规、血液生化指标检测结果等的差异。

1.3统计学方法

应用SPSS 22.0软件进行统计学处理。计量资料数据符合正态分布者以±s表示，两组间均数比较采用t检验；多组间均数比较采用单因素方差分析检验，组间两两比较采用SNK-q检验。计数资料数据以频数和百分率表示，多组间比较采用χ2检验，结果选取Pearson卡方检验值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1TLR4 rs2737190位点基因多态性与发病关系

观察组和对照组TLR4基因rs2737190位点基因型分布经Hard-Weinberg检验符合遗传平衡，差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组比较，观察组TLR4基因rs2737190位点AG基因型、G等位基因频率高于对照组，AA基因型频率低于对照组，差异有统计学意义（χ2=4.129～8.564，P<0.05）。提示TLR4基因rs2737190位点基因突变可能与本地区儿童RRTI易感性有关。见表2。

2.2TLR4 rs2737190位点基因多态性与病情关系

与RRTI病情轻度组病儿比较，中重度组GG基因型、G等位基因频率明显升高，AA基因型频率明显降低，差异有统计学意义（χ2=9.233～12.373，P<0.05）。提示TLR4基因rs2737190位点基因多态性与RRTI病情进展有关，其中GG基因型病儿病情严重的风险更高。见表3。

2.3TLR4rs2737190位点基因型与临床特征关系

AA基因型RRTI病儿的年发作次数、合并呼

吸困难比例，以及CRP、IL-6、IFN-γ和MDA水平

均明显低于AG和GG基因型，而SOD水平明显高于AG和GG基因型，差异均有统计学意义（χ2=7.573，F=4.668～24.317，P<0.05）。不同基因型病儿性别、年龄和体温比较，差异均无显著性（P>0.05）。提示TLR4基因rs2737190位点AG和GG基因型的RRTI病儿可能具有更严重的全身免疫炎症反应和病情。见表4。

3讨论

RRTI是指每年发生上下呼吸道感染超过一定范围的呼吸系统疾病，约占儿科门诊就诊病例1/3，随着人们生活方式及居住环境变化，其发病率有逐年升高趋势[9]。目前认为免疫功能缺陷[10]、营养不良[11]、病原体感染[12]等因素可能是引发RRTI的重要机制，其中以免疫炎症反应与RRTI关系最为密切。TLR4信号通路及相关炎症细胞因子与机体免疫功能密切相关，其表达水平能在一定程度上反映机体免疫水平[13-15]。因此，探究TLR4信号及炎症因子表达与RRTI关系具有一定临床意义。

TLR4是一种非催化性的跨膜蛋白，能通过识别异常病原微生物的内毒素、脂多糖、坏死细胞释放的热休克蛋白来刺激机体的免疫应答[16]。TLR4能在这些获得性免疫识别作用下促进抗原提呈细胞活化，而后者活化后可分泌IL-6、IFN-γ等细胞因子参与细胞免疫炎症反应[17-19]。相关研究显示，在肺部感染病人中血清TLR4 mRNA表达高于正常人群，提示TLR4 mRNA表达升高可能增加下呼吸道感染风险[20]。还有研究结果显示，在幽门螺杆菌感染胃部过程中，TLR4被发现能通过靶向下游蛋白调控机体对幽门螺杆菌的抗感染免疫[21]。近年来多项研究结果显示，遗传因素也是引发不同儿童个体对RRTI易感性的重要因素之一[22]。TLR4基因Asp299Gly位点多态性在国外研究中较多，但在国内研究较少。相关基因测序机构发现，rs2737190基因位点是汉族人群中较为常见的SNP多态性位点[23]。rs2737190位点在TLR4基因启动子区域，能直接影响TLR4 mRNA转录与表达[24]。本文研究结果显示，观察组TLR4基因rs2737190位点的AG基因型、G等位基因频率均显著高于对照组，野生纯合AA基因型频率则显著低于对照组，提示TLR4基因rs2737190位点基因突变可能与本地区儿童RRTI易感性有关。已有研究结果显示，新生儿气管插管后呼吸道感染病儿rs2737190位点AA基因型频率明显低于未发生感染病儿，提示TLR4基因rs2737190位点AA基因型可能是呼吸道感染的保护因素[25]。相关研究结果还显示，TLR4基因rs2737190位点GG基因型慢性阻塞性肺疾病病人TLR4表达更高[21]，提示GG基因型可能更具有病原体易感性。本研究结果表明，中重度RRTI病儿GG基因型、G等位基因频率均显著高于轻度病儿，AA基因型频率显著低于轻度病儿，提示TLR4基因rs2737190位点基因多态性与RRTI病情进展有关，其中GG基因型病儿病情严重的风险更高。还有研究认为，基因多态性可以影响RRTI易感性及进展，还可能对预后具有一定的预测价值[26-28]。本研究也显示，AA基因型病儿年发作次数、合并呼吸困难比例，以及CRP、IL-6、IFN-γ、MDA等指标均显著低于AG和GG基因型病儿，SOD则显著高于AG和GG基因型病儿，提示该位点AG和GG基因型病儿可能具有更严重的全身免疫炎症反应，因此病情更为严重。因此，临床针对该位点GG基因型病儿可增加其随访频率，并在发病后尽快明确病情和及时治疗。

综上所述，TLR4基因rs2737190位点AG基因型、G等位基因频率会增加小儿RRTI易感性，并促进其病情进展，临床可针对此类病儿予以针对性的预防。但本研究尚有不足之处：一是TLR4基因存在多个多态性位点，本次仅纳入了rs2737190位点，其他可能影响RRTI易感性的位点有待研究，且不同位点之间也可能存在交叉效应；二是本次纳入样本数较少，对于rs2737190位点与疾病病因及病原学之间关系尚不明确，需进一步分析其临床价值，具体机制有待后续研究、论证和完善。

［参考文献］

[1]辛超君，曹利静. 家庭管理模式下儿童下呼吸道感染出院后1年内并发症及生活质量分析[J]. 河北医药， 2022，44（4）：574-577.

[2]黄娟，王桂兰，刘翔腾，等. 学龄前儿童反复呼吸道感染的基础疾病谱及危险因素[J]. 广西医学， 2021，43（1）：84-88.

[3]钟晓英，王琪，郭秀静，等. 儿童反复呼吸道感染影响因素的Meta分析[J]. 四川医学， 2022，43（3）：247-252.

[4]蒋国凤，颜春鲁，安方玉，等. miRNA介导的TLR4炎症信号通路在辐射损伤中的研究进展[J]. 中国现代应用药学， 2022，39（11）：1495-1502.

[5]杨雪娇，白宝鑫，柯盈月. 哮喘患儿Toll样受体4基因多态性及其与哮喘发病的关系[J]. 山东医药， 2023，9（6）：61-63.

[6]石赟，陈艳蓉，张净，等. NLRP3、GSTs、TLR4基因多态性与COPD易感性的关联分析[J]. 重庆医学， 2022，51（14）：2392-2396.

[7]刘萍，李毅，王波，等. TLR4基因多态性和支原体感染及HPV感染与原发性肺癌的易感性[J]. 中华医院感染学杂志， 2021，31（17）：2618-2622.

[8]中国医师协会儿科医师分会过敏学组，中华医学会儿科学分会呼吸学组，中国医师协会儿科医师分会风湿免疫学组，等. 儿童反复呼吸道感染临床诊疗路径（2022版）[J]. 中国实用儿科杂志， 2022，37（3）：161-168.

[9]CHIAPPINI E， SANTAMARIA F， MARSEGLIA G L， et al. Prevention of recurrent respiratory infections： Inter-society Consensus[J]. Italian Journal of Pediatrics， 2021，47（1）：211.

[10]PASTERNAK G， LEWANDOWICZ-USZYSKA A， KR-

LAKOLEJNIK B. Recurrent respiratory tract infections in children[J]. Polski Merkuriusz Lekarski： Organ Polskiego Towarzystwa Lekarskiego， 2020，49（286）：260-266.

[11]杨海军，肖金凤. 维生素D对反复呼吸道感染患儿免疫功能和临床疗效的影响[J]. 国际流行病学传染病学杂志， 2019，46（2）：126-130.

[12]CIPRANDI G， MANTIA I L， DAMIANI V， et al. Local Bacteriotherapy-a promising preventive tool in recurrent respiratory infections[J]. Expert Review of Clinical Immunology， 2020，16（11）：1047-1052.

[13]FRANCOS-QUIJORNA I， SANCHEZ-PETIDIER M， BURN-

SIDE E R， et al. Chondroitin sulfate proteoglycans prevent immune cell phenotypic conversion and inflammation resolution via TLR4 in rodent models of spinal cord injury[J]. Nature Communications， 2022，13（1）：2933.

[14]刘艳玲，袁娟，郭敏，等. 基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路探讨黄芪多糖对肺癌小鼠免疫功能的影响及对Th1/Th2的调节作用[J]. 中国免疫学杂志， 2021，37（6）：676-682.

[15]李莉，刘丽娟，乜明金，等. 小儿咳喘灵颗粒联合维生素D3治疗儿童支气管哮喘的效果及TLR4/NF-κB信号通路的干预作用[J]. 中国免疫学杂志， 2022，8（15）：1872-1877.

[16]CIESIELSKA A， MATYJEK M， KWIATKOWSKA K. TLR4 and CD14 trafficking and its influence on LPS-induced pro-inflammatory signaling[J]. Cellular and Molecular Life Sciences， 2021，78（4）：1233-1261.

[17]阎丽，张春霞，孙希蓉，等. β-内酰胺类抗菌药物联合胸腺肽治疗慢阻肺并发肺部感染的临床疗效[J]. 中华医院感染学杂志， 2021，31（10）：1517-1521.

[18]黄政，涂荣会，钟国强，等. 缺氧后适应中HSP70对心肌细胞TLR4/NF-κB信号通路及免疫炎性损伤的影响[J]. 现代免疫学， 2021，41（5）：386-391.

[19]刘建军，李元贞，王多贤，等. MiR-146a介导TLR4/NF-κB信号通路延缓骨关节炎的作用及机制[J]. 中国骨质疏松杂志， 2023，29（10）：1523-1527.

[20]王严慧，刘东平，李岩，等. 幽门螺杆菌感染与急性胆囊炎术后感染 TLR4/NF-κB信号通路表达的关系[J]. 中华医院感染学杂志， 2022，32（18）：2833-2837.

[21]LI Z Q， MAO X H， LIU Q， et al. Functional variations of the TLR4 gene in association with chronic obstructive pulmonary disease and pulmonary tuberculosis[J]. BMC Pulmonary Medicine， 2019，19（1）：184.

[22]夏翡，李羚. 儿童反复呼吸道感染发病影响因素的研究进展[J]. 生命科学仪器， 2023，21（5）：22-24.

[23]朱乔波，江余明，黄华飞，等. 新生儿气管插管后呼吸道感染影响因素及与TLR4基因的关联[J]. 中华医院感染学杂志， 2022，32（5）：779-783.

[24]张之海，戴垚垚，陈杰，等. IL-17、TLR4、P2X7基因多态与慢性阻塞性肺疾病的关联研究[J]. 中华疾病控制杂志， 2018，22（2）：142-146，152.

[25]COLN-CASTRO C A， FRANCO-CENDEJAS R， ROCHA-GONZALEZ H I， et al. Association of TLR4 gene polymorphisms with sepsis after a burn injury： findings of the functional role of rs2737190 SNP[J]. Genes and Immunity， 2021，22（1）：24-34.

[26]马宏，周立，夏家敏，等. TIRAP基因多态性与儿童反复下呼吸道感染的关联性[J]. 中华医院感染学杂志， 2021，31（17）：2707-2711.

[27]杨庆华，娄莹，刘雪琴，等. β2-肾上腺素能受体基因多态性与儿童反复呼吸道感染的关联[J]. 中华医院感染学杂志， 2023，9（7）：1098-1101.

[28]徐培青，梁冰，韩菲，等. 干扰素-γCA重复序列基因多态性与肥胖儿童肺炎支原体感染及反复呼吸道感染的关联[J]. 中华医院感染学杂志， 2023，9（13）：2071-2074.

（本文编辑于国艺）