Exendin-4对小鼠黑质网状部神经元自发放电影响

［摘要］目的探究胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂Exendin-4对小鼠黑质网状部神经元自发放电的影响。

方法采用免疫荧光染色观察GLP-1受体（GLP-1R）在小鼠黑质网状部的表达。使用在体电生理微电极注射10 μmol/L的 Exendin-4到小鼠黑质网状部神经元表面，观察黑质网状部非多巴胺能（假定为γ-氨基丁酸能）神经元的自发放电变化。

结果免疫荧光染色结果显示，小鼠黑质网状部有GLP-1R的高表达。在所记录到的13个黑质网状部神经元中，Exendin-4可显著降低其中9个神经元的自发放电，其放电频率由加药前（18.62±3.19）Hz降低到（14.615±3.06）Hz，差异有显著性（t=7.257，P<0.05）；其放电频率平均降低（21.85±7.72）%，较生理盐水组的（1.15±9.67）%显著升高（Z=2.282，P<0.05）。在另外的4个黑质网状部神经元中，Exendin-4对放电频率无明显影响，其放电频率由（13.49±7.16）Hz变为（13.54±7.45）Hz，差异无显著性。

结论Exendin-4能降低部分黑质网状部神经元的自发放电频率。

［关键词］艾塞那肽；黑质；网状部；胰高血糖素样肽-1受体；电生理学；小鼠， 近交C57BL

［中图分类号］R977.15；R322.81

［文献标志码］A

［文章编号］2096-5532（2024）04-0491-05doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.092

［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［网络出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240726.0930.004;2024-07-2616：42：48

Effect of Exendin-4 on the spontaneous discharge of neurons in the substantia nigra pars reticulata of mice

SHEN Fangshuai， LI Xiaoxue， LIU Cui， CHEN Xinyi， XUE Yan， CHEN Lei

（Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University Medical College， Qingdao 266071， China）; ［Abstract］ObjectiveTo investigate the effectof Exendin-4， a glucagon-like peptide-1 （GLP-1） receptor agonist， on the spontaneous discharge of neurons in the substantia nigra pars reticulate of mice.

MethodsImmunofluorescent staining was used to observe the expression of GLP-1receptor （GLP-1R） in the substantia nigra pars reticulata of mice. Extendin-4 10 μmol/L were injected onto the surface of neurons in the substantia nigra pars reticulate using in vivo electrophysiological microelectrodes to observe the spontaneous discharge of non-dopaminergic neurons （assumed to be GABAergic neurons） in the substantia nigra pars reticulate.

ResultsImmunofluorescent staining showed a high expression level of GLP-1R in the substantia nigra par reticulate of mice. As for the 13 neurons recorded in the substantia nigra par reticulata， Exendin-4 significantly reduced the spontaneous discharge rate of 9 neurons， with a significant reduction in discharge frequency from （18.62±3.19） Hz to （14.615±3.06） Hz （t=7.257，P<0.05）， and the discharge frequency was reduced by （21.85±7.72）% on average， which was significantly higher than the reduction rate of （1.15±9.67）% in the normal saline group （Z=2.282，P<0.05）. In the other 4 neurons， Exendin-4 had no signi-

ficant effect on discharge frequency， which changed from （13.49±7.16） Hz to （13.54±7.45） Hz.

ConclusionExendin-4 can reduce the spontaneous discharge frequency of some neurons in the substantia nigra pars reticulata.

［Key words］exenatide; substantia nigra; pars reticulata; glucagon-like peptide-1 receptor; electrophysiology; mice， inbred C57BL

胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体（GLP-1R）是一种G蛋白偶联受体[1]。GLP-1R激动剂被许可用于治疗2型糖尿病，其作用是刺激胰腺中的GLP-1R，从而触发胰岛素的释放。同时，研究发现大脑中广泛存在GLP-1R的表达[2-3]。黑质网状部主要由γ-氨基丁酸（GABA）能神经元构成，神经元数量相对黑质致密部较为稀疏。黑质网状部GABA能神经元群是调控运动和觉醒睡眠的中枢部位[4-5]。这些GABA能神经元整合广泛的输入，并通过神经传导支配多个促觉醒和运动控制回路[4]。在帕金森病（PD）中，不仅伴随着黑质致密部多巴胺能神经元放电变化，还有黑质网状部GABA能神经元接受来自丘脑底核的兴奋性输入，这些神经元被过度激活最终抑制丘脑和运动皮质活动[5-6]。近年来，越来越

多的研究结果表明GLP-1R激动剂在PD中对神经元起保护作用，能够改善PD临床表现中的运动和非运动缺陷[7-8]。然而，GLP-1R激动剂是否能调控黑质网状部的GABA能神经元从而参与运动控制，目前尚不明确。本实验使用免疫荧光染色和在体电生理记录的方法，探究GLP-1R激动剂Exendin-4对小鼠黑质网状部GABA能神经元自发放电的影响。现将结果报告如下。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1主要试剂及来源Exendin-4购自英国Tocris公司，氨基甲酸乙酯（又称乌拉坦）购自上海麦克林生化科技有限公司，乙酸钠和滂胺天蓝购自美国Sigma公司。GLP-1抗体购自美国AbclonawnezZ0YQSvIX4Jn1+/0JEA==l公司；山羊抗兔二抗购自英国Abcam公司；酪氨酸羟化酶（TH）抗体购于英国Abcam公司。

1.1.2动物选择及处理7～8周的雄性C57小鼠由济南市朋悦实验动物繁育有限公司提供。小鼠饲养在室温（23±1）℃、12 h-12 h昼夜循环光照、湿度50%～60%的实验环境中，具备自由进食和饮水的条件。小鼠适应环境1周后用于实验。动物使用符合实验医学伦理学要求。

1.2实验方法

1.2.1在体细胞外电生理记录小鼠腹腔注射200 g/L乌拉坦（1 g/kg体质量）进行麻醉，实验中使用恒温加热板维持实验动物体温稳定。麻醉后对小鼠进行脑立体定位手术（前囟后2.8～3.6 mm，旁开1.0～2.0 mm，深度4.0～5.0 mm）。使用微玻璃电极拉制仪拉制三管电极，其中一支记录电极中加入含有0.5 mol/L乙酸钠和20 g/L滂胺天蓝染料的混合液，其余两支电极则分别加入10 μmol/L的Exendin-4[9]和生理盐水。在体细胞外电生理记录过程中，观察放电频率及形状，通常认为黑质网状部神经元放电若为非多巴胺能神经元放电即可假设为GABA能神经元[10]。多巴胺能神经元放电频率通常在4～6 Hz范围内[10]，易于辨认。小鼠脑中的生物电信号被信号放大器和数模转化器扩大，应用Spike2软件收集、记录并处理放大后的电信号。当电极尖端到达黑质网状部并记录到稳定的神经元自发放电300 s后，通过生物细胞纳升注射器将上述药物注射到神经元表面，观察药物对神经元放电频率及放电模式的影响。神经元的基础放电频率为给药前120 s的平均频率，加药后的反应频率为加药后反应高峰处50 s的平均频率。如果给药后神经元放电频率的变化超过基础放电频率均数±2个标准差，则认为该神经元对该药物有反应，否则认为该神经元为无反应神经元。

1.2.2免疫荧光染色小鼠深度麻醉后，经心脏先后灌注冰冷生理盐水和40 g/L多聚甲醛，之后断头取脑，将鼠脑浸泡于40 g/L多聚甲醛溶液中并置4 ℃冰箱固定6～8 h。之后，脑组织先后浸泡于200和300 g/L蔗糖溶液脱水，直至脑组织自动沉到溶液底部。然后，使用冰冻切片机进行切片，脑片厚度为20 μm，取含有黑质的脑片进行免疫染色。将脑片以磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次，每次置于摇床5 min，室温孵育并以体积分数0.05的胎牛血清封闭1～2 h。弃去封闭血清后加一抗，于4 ℃冰箱摇床孵育8 h。吸出一抗，用PBS冲洗3次后加二抗鼠源TH抗体和兔源GLP-1R抗体，室温孵育1 h。充分冲洗二抗后将脑片贴附于经多聚赖氨酸处理的载玻片上，脑片晾干后滴加抗荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片。在奥林巴斯荧光显微镜下观察免疫荧光反应并拍摄图像。

1.3统计学处理

使用SPSS 26软件进行统计学分析。所得计量资料数据以±s形式表示，神经元加药前后的放电频率均数比较采用配对t检验；两组计数资料数据神经元自发放电频率变化率以百分数表示，两组比较采用曼-惠特尼秩和检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1黑质网状部神经元GLP-1R的表达

免疫荧光染色显示，黑质网状部神经元有大量的GLP-1R表达，尤其是在黑质网状部的背外侧部。提示正常小鼠黑质网状部的神经元活动很有可能受到GLP-1及其受体激动剂的调控。见图1。

2.2Exendin-4对黑质网状部神经元自发放电频率影响

在记录到的6个黑质网状部神经元中，微压力注射生理盐水后，其放电频率由（18.05±7.57）Hz变为（17.56±7.58）Hz，差异无显著性（t=0.562，P=0.614）；平均反应百分数为（1.15±9.67）%。在微压力给予10 μmol/L的 Exendin-4后所记录到的10个黑质网状部神经元中，Exendin-4能够显著降

低其中9个神经元的自发放电，其放电频率由加药SNr：黑质网状部；SNc：黑质致密部；Ventral SNr：黑质网状部腹侧；Dorsolateral SNr：黑质网状部背外侧。绿色为TH染色，红色为GLP-1R染色。

前（18.62±3.19）Hz降低到（14.62±3.06）Hz，差异有显著性（t=7.257，P<0.05）；放电频率平均降低（21.85±7.72）%，与生理盐水组比较差异有显著性（Z=2.282，P<0.05）。在另外的4个黑质网状部神经元中，Exendin-4对放电频率无明显影响，其放电频率由（13.49±7.16）Hz变为（13.54±7.45）Hz，差异无显著性（t=－0.247，P=0.821）。见图2。

2.3Exendin-4对黑质网状部神经元放电模式影响

通过计算放电间隔直方图和自相关图对黑质网状部神经元的放电模式进行分析，本实验只记录到一种黑质网状部神经元基础放电模式，即规律性放电。在给予Exendin-4后，神经元放电模式与加药前比较显示，在对Exendin-4有反应的9个和无反应的4个神经元中，Exendin-4均不改变神经元的放电模式。

3讨论

黑质网状部的GABA能神经元在正常生理条件下参与机体的运动控制和觉醒[4-5]。尤其是黑质网状部谷氨酸脱羧酶2（GAD2）阳性的GABA能神经元的共同激活或失活，介导了自主行为方向的转变、促进或抑制睡眠。这类GAD2阳性的GABA能神经元整合广泛的输入，并通过广泛的侧支投射来支配多个促觉醒和运动控制环路[4]。在疾病条件下，黑质网状部GABA能神经元非正常放电引起癫痫的症状发生。许多调控黑质网状部GABA能神经元放电的药物被证实可以减轻癫痫症状的发生并用于治疗[11]。此外，在PD的经典环路理论中，黑质网状部GABA能神经元接受来自丘脑底核谷氨酸能神经元的兴奋性输入，导致GABA能神经元过

分激活，GABA释放过量，造成丘脑和运动皮质被抑制。因此，黑质网状部GABA能神经元的放电活动对机体的运动控制功能非常重要。

以往的文献报道，大脑中GLP-1R的激活通常可以抑制电压门控的钾通道开放，增加神经元放电频率，加强神经递质的释放[8]。有研究表明，GLP-1R激动剂利拉鲁肽增加了来自未饮酒大鼠的中央杏仁核（CeA）和边缘下区（ILC）神经元的自发抑制性突触后电流频率，表明GABA释放增强[12]。然而与之前研究不同的是，本实验表明给予Exendin-4可以降低部分黑质网状部GABA能神经元的自发放电频率。这可能是GLP-1R通过激活ERK1/2的不同作用来实现下游表达的多样性所导致的[1]。有研究结果表明，GLP-1R激活的结果可能因空间和时间因素而异，其中区室化可能导致下游信号的

激活受到抑制，这种微结构域的形成已被证明影响

GLP-1R信号传导，例如PKA诱导的ERK1/2的激活已被证明是短暂的，并导致其易位到细胞核[13-14]。这种药物的效果差异可能来源于网状部GABA能神经元的高频放电和脑区环路的不同，本实验神经元放电频率抑制效果的信号机制需要进一步的实验探究。GLP-1或Exendin-4可通过分离的大鼠视网膜神经节细胞中的GLP-1R抑制γ-氨基丁酸受体介导的电流。预孵育刺激性G蛋白抑制剂消除了Exendin-4的作用。此外，当钙调素和钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ的活性被抑制时，Exendin-4效应被消除[15]。然而，NPY/AgRP神经元中的电生理研究表明，GLP-1通过增加GABAA受体介导的局部GABA能中间神经元的GABA神经传递间接抑制了NPY神经元超极化。同时，GLP-1可能引起神经元钾离子通道开放抑制其超极化和放电频率，最终使得小鼠在黑暗中进食被抑制[16-17]。最后，在黑暗条件下，将GLP-1注射到终纹床核神经元中减少了食物摄入，而注射GLP-1R拮抗剂Exendin9-39增加了进食[17]。终纹床核神经元的全细胞膜片钳记录表明，GLP-1能引发可逆性神经元去极化或超极化反应[17-18]。这些研究表明，GLP-1R激活可能引起神经元发生复杂的放电反应[17]。本实验结果符合Exendin-4等GLP-1类似物或者激动剂改善运动障碍的研究结论。然而，未来需要在PD动物模型上进一步确认GLP-1R激动剂是否能降低黑质网状部GABA能神经元的放电频率，以及联合给予GLP-1R阻断剂来确认Exendin-4和内源性GLP-1对此类神经元的调控作用。许多研究已经证明，Exendin-4等GLP-1R激动剂在PD模型中有神经保护作用，可改善运动和非运动缺陷[7，19-24]。GLP-1可以调节黑质多巴胺能神经元的放电活动，降低炎症反应，增加多巴胺能神经元存活率，并且对其起到保护作用[25-30]。在PD条件下GLP-1不仅可以通过多巴胺能神经元起到神经保护作用，还可能通过降低作为主要输出核团的黑质网状部过度激活的GABA能神经元的放电频率，从而参与减轻对丘脑和皮质的抑制性输入，最终改善PD的自主运动失调等症状。这可能对传统GLP-1减轻PD运动障碍的机制有新的意义。

有研究表明，使用在体电生理技术在黑质网状部背外侧能更容易记录到神经元的自发放电[10]。而这部分黑质网状部背外侧神经元主要分布着小清

蛋白阳性的GABA能神经元[4]。本实验中所记录到

的神经元放电大多来自黑质网状部背外侧。未来实验可以进一步探究黑质网状部背外侧和内侧的神经元放电是否有差异。同时，本研究证实GLP-1R激动剂可以调控部分GABA能神经元的活动，而不是所有的黑质网状部GABA能神经元都受到GLP-1R激动剂的调节。结合本文免疫荧光染色结果，这可能是由于黑质网状部有两种或多种GABA能神经元，其中部分GABA能神经元很少表达或者不表达GLP-1R。有研究表明，网状部GABA能神经元并非全部同质，黑质网状部的GABA能神经元大致可以分为小清蛋白阳性神经元和GAD2阳性神经元，其中GAD2阳性神经元更靠近黑质网状部内侧[4]。本研究中的免疫荧光染色结果显示，GLP-1R更多地表达在黑质网状部背外侧，即小清蛋白阳性的GABA能神经元主要分布的位置。

综上所述，本文在体电生理技术检测显示，在小鼠黑质网状部微量注射GLP-1R激动剂Exendin-4可以降低部分GABA能神经元的自发放电频率。同时，本实验免疫荧光染色的结果表明，黑质网状部背外侧神经元大量表达GLP-1R。这一实验结果提示，GLP-1R及其激动剂可能通过调控黑质致密部GABA能神经元的放电活动，从而改善PD等疾病中的行为障碍。

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（本文编辑于国艺）