基于万古霉素高效还原Ag纳米粒子体系的分光光度法检测

摘要：万古霉素（vancomycin，Van）是临床实践中常用的抗生素，其用于预防传染病，但在环境水微量污染物检测中常常被忽略。利用溶剂热反应过程中Ag+选择性氧化Van中酚类羟基团特性，开发了一种利于分光光度法检测废水中Van的方法。探讨了反应温度和时间等对氧化还原反应的影响，建立了Van质量浓度（concentration，C）与Ag纳米粒子溶液吸光度（absorbance，A）之间的线性关系。发现C与A呈双线性关系：在线性浓度范围为1～15μg/mL时，线性关系为A1=0：001 7+0：012C1，检测限为0.5μg/mL；在20～40μg/mL时，A2=0：11+0：005 5C2。该方法成功应用于废水中Van检测，回收率为96.0%～104.5%，废水中可能存在其他物质或颗粒，干扰了Van的测量，导致回收率计算结果超过100%。

关键词：万古霉素；银纳米粒子；光谱法；检测

中图分类号：TQ 465；O 657.3文献标志码：A

Spectrophotometric determination of vancomycin based on its highly-efficient reduction performance to Agnanoparticle

PENG Shen1，ZHOU Liuyan2，CHEN Aiying1，MAO Yanfei2，REN Rongrong2

（1.School of Materials and Chemistry，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China;

2.Department of Anesthesiology and Surgical Intensive Care Unit，Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao TongUniversity School of Medicine，Shanghai 200092，China）

Abstract：Vancomycin（Van）is a typical antibiotic in clinical practice to prevent infectious diseases，which is generally neglected in the detection of trace pollutant in environmental water.A spectrophotometric method is developed to detect Van in waste water based on Ag nanoparticles，which involves a selective reduction of Ag+by the phenolic-hydroxyl groups of Van to obtain differentconcentrations of Ag nanoparticles during the solvothermal reaction.By optimizing experimental conditions of reaction temperature and time，a bi-linear relationship between Van concentration（C）and absorbance（A）of Ag solution is established，represented by A1=0.001 7+0.012C1 in a linear concentration of 1-15μg/mL with a detection limit of 0.5μg/mL，and A2=0.11+0.005 5C2 of 20-40μg/mL.This method successfully applied to detect Van in waste water with a recovery rate of 96.0%-104.5%possibly due to other substances or particles in the wastewater that interfere with the measurement of Van and cause the calculated recovery rate exceeding 100%.

Keywords：vancomycin;Agnanoparticles;spectrophotometricmethod;detection.

万古霉素（vancomycin，Van）是目前临床上使用的一种典型抗生素，可抑制细菌蛋白质合成，有效治疗各种传染病[1]。在抗生素耐药细菌的背景下，Van对某些细菌，如革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，引起的感染表现出良好的疗效[2-4]。在畜牧业方面，Van作为畜禽饲料添加剂也广泛应用，其有助于预防和治疗动物感染[5-6]，从而加快生长速度，提高饲料利用率，提高农业效率。然而，Van的广泛应用也引发了一些挑战。其中主要关心的问题是排放。当患者接受Van治疗时，一些未代谢的残留物会通过粪便和尿液进入环境，导致水体中存在Van。残留的Van可能会对环境和生态系统产生负面影响，导致抗生素耐药性的传播[7-8]。另一个挑战在于对Van的检测。传统的检测方法通常基于高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography，HPLC）或质谱法[9]，涉及复杂的样品制备和分析程序，不适合快速且低成本检测。其他检测Van方法，如，Cetinkaya等[10]采用电化学方法检测Van，使用藻酸盐和TiO2在玻碳电极（glassy carbon electrode，GCE）上制备出敏感分子印迹电化学传感器。Rahinpur等[8]使用铜纳米团簇开发了一种同步荧光光谱（synchronous fluorescence spectroscopy，SFS）纳米探针，用于测定呼气冷凝物（exhaled breath condensate，EBC）样品中的Van，检测限为0.18μg/mL。Iranifam等[11]发现，Van抑制了NiS纳米粒子（nanoparticles，NPs）−鲁米诺−O2反应的化学发光强度，可用于测量Van。这些方法均需特定设备和专业人员，限制了其在现场和大规模测试中的适用性。因此，需要一种新的检测方法，该方法应具有以下特点：简单、快速、成本低、样品用量少，不需要特殊设备。这将有助于监测和控制Van的使用，同时提供及时的数据支持。

Ag NPs因其独特的性质，如表面增强拉曼散射（surface enhanced raman scattering，SERS）、可调光学性质、优异的导电性和生物相容性，被广泛应用于生物医学、传感器技术、催化剂和其他领域[12-13]。这些独特的特性可以通过控制Ag NPs的尺寸、形状和表面改性来获得[14]。在检测领域，Ag NPs表现出快速的反应动力学和灵敏性，允许快速响应和实时监测[15-16]。这些优势使Ag NPs适合于快速检测和现场分析，特别是用于需要实时监测的应用环境。因此，Ag NPs已被用于分光光度法检测不同类型的抗生素[17-18]。例如，Zhou等[17]利用Ag NPs的SERS测定牛奶中抗生素苄青霉素钠和氨苄青霉素的残留物。Bakhshpour等[18]设计了基于分子印迹聚合物的表面等离子体共振效应从水溶液和牛奶样品中选择性识别青霉素G（penicillin-g，PEN-G）抗生素。这些成功的应用证明了Ag NPs在抗生素检测领域的潜力。

本项工作中，通过利用Van的酚羟基将Ag+选择性还原为Ag NPs，基于Ag NPs溶液的吸光度（absorbance，A）与Van质量浓度（concentration，C）的依赖性，建立了一种分光光度法来检测Van方法。研究了溶剂热还原Ag NPs的微观结构特征、检测Van的灵敏度和选择性。最后，成功采用此方法检测了废水中Van质量浓度，获得了良好的回收率。

1材料与方法

1.1材料和试剂

Van（USP级）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，质量浓度≥96.0%。硝酸银、氢氧化钠、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）均为分析纯级化学试剂，购于中国国药集团化学试剂有限公司。布里顿−罗宾逊（britton-robinson，BR）缓冲溶液（pH=6.0）由浓度均为0.04 mol/L的磷酸、乙酸、硼酸按照质量比1：1：1的比例混合溶液配制，所有试剂均由上海阿拉丁生化技术有限公司提供。所有的溶液均使用去离子水配制。

1.2实验过程

Van还原法制备Ag NPs过程如图1所示。具体为，在棕色容量瓶（10 mL）中缓慢倒入1 mL不同质量浓度的Van溶液，再依次加入1.2 mL硝酸银溶液（浓度为3×10−3 mol/L）、1 mL PVP（0.14%）和1.2 mL氢氧化钠溶液（浓度为5×10−3 mol/L），然后将混合物放入90℃的水浴中恒温加热不同时间。制备的样品记录为Ag+Van+t（t为加热时间，为5、10、15、20 min），Van的质量浓度为10μg/mL。冷却至室温后，Ag+被Van还原生成Ag NPs，加入1 mLBR缓冲溶液，用蒸馏水定容至10 mL。在空白实验中，加入1 mL去离子水代替Van溶液，并标记为Ag+t（t为加热时间，为5、10、15、20 min）。

1.3分析方法

A使用波长范围为250～800 nm的PerkinElmer LAMBDA750紫外−可见分光光度计（ultraviolet-visible spectrophotometer，UV-vis，珀金埃尔默，美国）进行测量；利用扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）（FEI Quanta 450，美国）和透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）（FEI Tecnai F20，美国）分别分析了微观结构；拉曼光谱是采用532 nm激光的拉曼光谱仪（HR Evolution，法国）获得；采用X射线光电子能谱仪（X-ray photoelectron spectrometer，XPS）（ThermoKalpha，瑞士）测定化学元素。

2结果与讨论

2.1 Ag NPs微观结构

2.1.1 AgNPs形貌

图2显示了合成的Ag NPs的形貌。对于Ag+溶液中没有添加Van的Ag+20样品，Ag NPs颗粒较大，数量较少，如图2（a）和插图中的箭头所示，这表明由于没有Van，Ag+的还原速度很慢。然而，如图2（b）、（c）所示，所有Ag+Van样品中都发现了大量的Ag NPs。Ag NPs的数量随着反应时间从5 min延长到20 min而增加，而直径则相对减小。这些结果表明，Van的加入促进了Ag+的还原，从而形成了数量更多、尺寸更小的Ag NPs。从图2（d）Ag+Van+20样品的放大图可以看出，Ag NPs表面覆盖一层有机膜。图2（e）～（g）中的元素图证实Van中的C和C1元素均匀地包覆在Ag NPs表面。

图3（a）显示了不同反应时间下Ag NPs粒径，其中Ag+20的统计粒径约为100 nm。然而，当加入Van时，Ag NPs的粒径明显减小。例如，Ag+Van+5和Ag+Van+10的粒径分别为70 nm和60 nm，而Ag+Van+20的粒径较小，仅为45 nm。从图2（a）～（c）和图3（a）中可以看出，Van的加入明显促进了Ag+的还原形成Ag NPs，从而导致Ag NPs的大量增加和粒径的减小。如图3（b）所示，Ag NPs数量和大小的变化会导致A相应变化。与原始Ag样品相比，Ag+Van+5和Ag+Van+10的A值显著增加。图3（c）显示了Ag+Van样品在不同反应温度下的A值，3次实验中使用的Van质量浓度均为10μg/mL，加热时间固定为20 min。随着加热温度升高，A逐渐增大。具体来说，在70℃时，A值为0.037，80℃时为0.079，90℃时为0.137，表明Van对Ag NPs的还原受温度的影响很大。Ag和Ag+Van+20样品的拉曼光谱在803、905、1 073、1 608 cm−1[19]处显示出银氧化物的强峰。此外，在964、1 234、1 763 cm−1出现了新的振动峰，由羧基（C=O）的振动所致。这表明在Ag NPs表面存在含有羰基官能团的有机分子。Ag+Van+20样品显示出1 608 cm−1的轻微移动，这是由于Ag NPs与表面覆盖化合物之间的相互作用所致。

图4和图5分别为Ag+Van+20和Ag+20样品的TEM观察结果。与图5（a）Ag+20样品相比，图4（a）Ag+Van+20样品的粒径更小，数量更多，分布更均匀，这表明在合成过程中，Van的存在促进了Ag NPs的形成并改善了其聚集性。图4（b）中放大的TEM图显示了一个近似球状的颗粒，其晶格间距分别为0.313 nm和0.240 nm，分别对应于（200）和（111）晶面。Ag+20样品中发现了球形和多面体形状的颗粒，晶格间距为0.342 nm，对应于（220）晶面，如图5（b）的放大图像所示。根据上述实验结果，添加Van作为还原剂可促进Ag+的还原，从而导致粒径减小，而且还原反应与温度有关，在90 oC下20 min观察到的A最强。

2.1.2 Ag纳米粒子化学结构

图6（a）显示了Ag+Van+20和Ag+20样品的XPS光谱，其中Ag+Van+20样品除了含有Ag元素外，还含有源于Van的C、O和N元素。对比图6（b）Ag+20样品和图6（c）Ag+Van+20样品中Ag元素的结合能（binding energy，BE）发现，Ag+Van+20样品中Ag3d3/2和Ag3d5/2的BE都分别蓝移到了373.48、367.51 eV处。这是由于Van的吸附或表面还原反应造成的。Ag+Van+20样品的C 1s光谱图6（d）可分解成286.89、284.93 eV两个峰，分别对应于C=O和C-C/C=C键。拟合的O 1s光谱如图6（d）所示，其中531.78、532.38 eV处的峰分别对应于C-O、C=O键。C=O键的存在表明有机化合物中形成了羧基。Ag+Van+20样品的N 1s光谱图6（f）解析出4个峰，其中400.28 eV峰对应于N-H键、399.68 eV峰对应于N-C键、399.38 eV峰对应于C-N-C键、398.98 eV峰对应于C=N键。这些峰值来自Van中的含氮有机配位分子。

2.2万古霉素含量测定

2.2.1线性关系

由于AgNPs溶液A与Van的C密切相关。在Ag+溶液中加入不同质量浓度的Van（0～40μg/mL），在90°C下反应20 min。棕色溶液由浅变深，如图7所示。AgNPs溶液的典型吸光度曲线如图8（a）所示，可以看到Van质量浓度与吸光度A具有一定的规律性。进一步分析，图8（b）显示，随着Van质量浓度的增加，吸光度A逐渐增大，呈现出双线性关系，质量浓度范围分别为0～15μg/mL和20～40μg/mL。线性回归方程为A1=0：001 7+0：012C1和A2=0：11+0：005 5C2，线性相关系数分别为0.996 8和0.996 3。线性关系不同的原因可能是不同质量浓度的Van产生的AgNPs数量不同。低质量浓度Van还原率低，AgNPs的数量相对较少。而对于高质量浓度Van，在还原反应中会产生相对较多的Ag NPs，从而产生Ag NPs聚集，这也是线性方程斜率较小的原因。

2.2.2选择性和稳定性

为了评估UV-vis法检测Van的选择性和稳定性，进行了一系列干扰实验。分别加入了各种阳离子和阴离子作为干扰物质，以考察它们对A的影响，结果如图9所示。图9表明，阳离子和阴离子引起的A变化均小于10%。图10为Ag+Van+20溶液对Van检测的稳定性实验结果。表明含有5μg/mL Van的Ag+Van+20溶液在放置5、10、20、30 min时，A保持相对稳定，进一步证实了检测方法的可靠性和稳定性。

2.2.3环境废水检测应用

表1为废水中Van测定结果。由表1可知，该方法对Van的检测具有良好的选择性和稳定性，并已成功应用于废水中Van质量浓度的测定。通过对不同样品的检测和分析，得到的回收率为96.0%～104.5%。这些结果与实际添加的标准质量浓度一致，证明了这种检测方法的可靠性和准确性。废水中Van质量浓度的成功测定为分析废水中的有害Van提供了可行性，为环境监测提供了有力支持。

2.3 Van催化合成Ag NPs

Van含有酚羟基，表现出高度亲电性的特点，很容易提供电子和作为还原剂转化为苯醌。酚羟基还原成苯醌的电位约为−1.04 V[20]。图3（d）和图6（e）的结果验证了这一点。而Ag+/Ag的电极电位见方程1：

EAg+/Ag;90。C=（EA（0）g+/Ag+

式中：T为热力学温度；R为热力学常数；F为法拉第常数；E0为标准电极电位；n为转移电子物质的量。

90 oC下，该反应电极电位约为0.619 V。根据上述结果，Van可以有效地合成Ag NPs。其过程如图11所示。Ag+被Van的酚羟基还原，形成纳米级颗粒。与此同时，被氧化的Van分子吸附在Ag NPs表面，导致AgNPs被原位包覆、隔离形成游离的、稳定的纳米粒子。在Van将Ag+还原成AgNPs的过程中，会产生H+作为副产物，氢氧化钠溶液会对其进行中和，以保持反应体系的稳定性。利用Van分子中的酚羟基，实现了Ag+的高效还原，从而生成小尺寸的AgNPs。

3结论

利用Van酚羟基的还原性，合成了Ag NPs，从而实现了采用简便的UV-vis测定Van。其表现出良好的灵敏性、选择性以及稳定性。探讨了不同反应条件对Ag NPs微观结构的影响，讨论了Ag NPs与Van的合成机制。得出以下结论：

（1）利用Van还原性获得了不同粒径的Ag NPs（45～75 nm）。随着Van质量浓度的增加，Ag NPs的尺寸减小，且AgNPs的数量急剧增加。C随反应时间和温度的增加而增加，在90°C反应20 min时达到最大值。

（2）Van还原银粒子获得Ag NPs溶液的C在Van质量浓度0～40μg/mL范围内呈现双线性关系，检测限为0.5μg/mL。干扰实验表明，常见的阴离子和阳离子对Van检测的影响很小。在检测废水中Van质量浓度的实际应用中，测定相对误差小于2.4%、回收率为96.0%～104.5%。

（3）Van中的酚羟基具有强还原能力，可使Ag+转变为Ag NPs。拉曼和XPS分析证实溶剂热反应后形成C=C结构。此外，Van的质量浓度决定了AgNPs的数量，从而控制了A的大小。

参考文献：

[1]HAMAD A，KHASHAN K S，HADI A.Silver nanoparticles and silver ions as potential antibacterialagents[J].Journal of Inorganic and Organometallic Polymers and Materials，2020，30（12）：4811−4828.

[2]DEL ROSARIO-GARCÍIA B D，NAZCO-CASARIEGO G J，GOMEZ-SIRVENT J L，etal.Vancomycin versus daptomycin for the treatment of confirmed gram-positive catheter-related bloodstream infections in oncology patients[J].Farmacia Hospitalaria，2022，46（3）：105−108.

[3]JAVED M U，IJAZ M，FATIMA Z，etal.Frequency and antimicrobial susceptibility of methicillin and vancomycin-resistant staphylococcus aureus from bovine milk[J].Pakistan Veterinary Journal，2021，41（4）：463−468.

[4]KARAU M J，ZHANG C H，MANDREKAR J N，etal.Topical vancomycin for treatment of methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis infection in a rat spinal implant model[J].Spine Deformity，2020，8（4）：553−559.

[5]LOW C X，TAN L T H，AB MUTALIB N S A，etal.Unveiling the impact of antibiotics and alternative methods for animal husbandry：a review[J].Antibiotics-Basel，2021，10（5）：57817.

[6]ZHAO J F，LIU R，SUN Y P，etal.Tracing enterococci persistence along a pork production chain from feed to food in China[J].Animal Nutrition，2022，9：223−232.

[7]GALLER H，LUXNER J，PETTERNEL C，etal.Multiresistant bacteria isolated from intestinal faeces of farm animals in Austria[J].Antibiotics-Basel，2021，10（4）：46610.

[8]RAHIMPOUR E，KHOUBNASABJAFARI M，HOSSEINI M B，etal.Copper nanocluster-based sensor for determination of vancomycin in exhaled breath condensate：a synchronous fluorescence spectroscopy[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2021，196：113906.

[9]CHENG X，MA J X，SU J R.An overview of analytical methodologies for determination of vancomycin in human plasma[J].Molecules，2022，27（21）：731917.

[10]CETINKAYA A，YILDIZ E，KAYA S I，etal.A green synthesis route to develop molecularly imprinted electrochemical sensor for selective detection of vancomycin from aqueous and serum samples[J].Green Analytical Chemistry，2022，2：10001715.

[11]IRANIFAM M，DADASHI Z.Chemiluminescence determination of vancomycin by using NiSnanoparticles-luminol-O（2）system[J].Spectrochimica Acta Part A：Molecular and Biomolecular Spectroscopy，2022，267：120489.

[12]PISTONESI D B，CENTURIÓON M E，SPRINGER V.Green-tea-synthesized silver nanoparticles as a sensing platform for determination of tetracycline in honey samples[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，2021，101（12）：5182−5189.

[13]VERMA P，MAHESHWARI S K.Applications of silver nanoparticles in diverse sectors[J].International Journal of Nano Dimension，2019，10（1）：18−36.

[14]KHODASHENAS B，GHORBANI H R.Synthesis of silver nanoparticles with different shapes[J].Arabian Journal of Chemistry，2019，12（8）：1823−1838.

[15]RETOUT M，GOSSELIN B，MATTIUZZI A，etal.Peptide-conjugated silver nanoparticles for the colorimetric detection of the oncoprotein Mdm2 in human serum[J].ChemPlusChem：Chemistry of Interfaces，2022，87（4）：e2021004507.

[16]ZEEBAREE S Y S，HAJI O I，ZEEBAREE A Y S，etal.Rapid detection of mercury ions using sustainable natural gum-based silver nanoparticles[J].Catalysts，2022，12（11）：14648.

[17]ZHOU H L，LIANG Y F，ZHANG J G，etal.Detection of benzylpenicillin sodium and ampicillin residue based on flower-like silver nanostructures using surface-enhanced Raman spectroscopy[J].Research on Chemical Intermediates，2022，1，48（1）：117−128.

[18]BAKHSHPOUR M，GÖOKTÜURK I，BERELI N，etal.Selective detection of penicillin g antibiotic in milk by molecularly imprinted polymer-based plasmonic SPR sensor[J].Biomimetics（Basel），2021，6（4）：7220.

[19]VERMA A K，SONI R K.Ultrasensitive surface-enhanced Raman spectroscopy detection of explosive molecules with multibranched silver nanostructures[J].Journal of Raman Spectroscopy，2022，53（4）：694−708.

[20]HOSSEINI S，KHEAWHOM S，SOLTANI S M，etal.Electrochemical reduction of bicarbonate on carbon nanotube-supported silver oxide：an electrochemical impedance spectroscopy study[J].Journal of Environmental Chemical Engineering，2018，6（1）：1033−1043.

（编辑：何代华）