中国南瓜幼苗低氮耐受性指标筛选及综合评价

摘 要：氮肥过量施用是导致土壤退化及环境污染的重要原因之一，选育低氮耐受性较强的品种对中国南瓜的减肥增效生产具有重要意义。以8个中国南瓜种质为试验材料，采用水培法并设置适氮（7.0 mmol·L-1）和低氮（0.7 mmol·L-1）2个处理，测定苗期18个性状的低氮耐受系数，采用主成分、隶属函数和回归分析等方法建立中国南瓜低氮耐受性综合评价体系。结果表明，不同种质各指标的低氮耐受系数存在显著差异；主成分分析表明，一些表征植株生物量和叶片光合作用能力的指标与低氮耐受能力密切相关，其中根部干质量、根部鲜质量、根体积、壮苗指数等4个指标可作为低氮耐受性鉴定指标。利用回归分析建立中国南瓜幼苗低氮耐受性预测方程D’=0.950 9-0.121 2X1-0.207 7X2+0.134 1X3-0.078 2X4（平均估算精度96.5%，R2=0.957），筛选获得1份苗期低氮耐受性较强的种质Cmo19（柿饼南瓜），初步实现中国南瓜幼苗期低氮耐受性种质资源的快速筛选鉴定，为中国南瓜氮高效利用品种选育及相关机制研究提供了依据。

关键词：中国南瓜；低氮胁迫；筛选；综合评价

中图分类号：S642.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）09-074-07

Index screening and tolerance evaluation of low nitrogen stress in seedling stage of Cucurbita moschata

LIAO Qinggui1， 2， LU Qiuchen2， LIU Ying3， DONG Jiamei1， 2， SUN Yapei2， HE Yadi2， BO Kailiang2， WANG Wenjiao1， DUAN Ying2， WANG Changlin2

（1. College of Horticulture， Shanxi Agricultural University， Taigu 030801， Shanxi， China; 2. Institute of Vegetables and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Vegetable Biobreeding， Beijing 100081， China; 3. Harbin Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150030， Heilongjiang， China）

Abstract： Excessive application of nitrogen fertilizer is one of the major causes of soil degradation and environmental pollution. The selection of high-yielding varieties with strong low-nitrogen tolerance is of great significance for the efficient production in Cucurbita moschata. In this study， eight germplasm were used as experimental materials， and two treatments of suitable nitrogen（7.0 mmol·L-1）and low nitrogen（0.7 mmol·L-1）were set up in hydroponics to determine the low nitrogen tolerance coefficients of 18 traits in the seedling stage. The comprehensive evaluation system was established by using the methods of principal component， subordinate function and regression analysis. The results showed that the low nitrogen tolerance coefficients of different germplasm indicators differed significantly. The principal component analysis showed that the index characterizing plant biomass and photosynthesis were closely related to the low nitrogen tolerance ability， and that the four index， including root dry mass， root fresh mass， root volume and seedling index， could be used as index of the tolerance identification. Regression analysis was used to establish a predictive equation for low nitrogen tolerance in seedlings D’=0.950 9-0.121 2X1-0.207 7X2+0.134 1X3-0.078 2X4（R2=0.957， average estimation accuracy 96.5%）. One germplasm with strong low-nitrogen tolerance were finally obtained， namely Cmo19（Shibing Nangua）. This study initially realized the high-throughput screening and identification of low nitrogen tolerance germplasm resources in Cucurbita moschata during the seedling stage， which provided a theoretical basis for the selection and breeding of nitrogen-efficient varieties of Cucurbita moschata and the study related mechanisms.

Key words： Cucurbita moschata; Low nitrogen stress; Screening; Comprehensive evaluation

收稿日期：2024-05-29；修回日期：2024-06-27

基金项目：北京市设施蔬菜创新团队项目（BAIC01）；中国农业科学院科技创新工程（CAAS-ASTIP-IVFCAAS）

作者简介：廖青桂，女，在读硕士研究生，研究方向为南瓜遗传育种。E-mail：18434766932@163.com

通信作者：王文娇，女，副教授，研究方向为蔬菜分子生物学。E-mail：sxndwwj@sxau.edu.cn

段 颖，女，助理研究员，研究方向为南瓜遗传育种。E-mail：duanying@caas.cn

王长林，男，副研究员，研究方向为南瓜遗传育种。E-mail：wangchanglin@caas.cn

氮元素（nitrogen，N）是生命体重要有机分子的基本组成元素之一，也是决定植物生长发育、产量及品质形成的重要营养元素之一[1]。氮元素缺乏会导致植物细胞生理生化活动受到抑制，降低作物产量和品质[2]。尽管大量施加氮肥可以提高作物产量，但也会引起资源浪费、土壤污染和破坏农田生态系统等一系列问题[3]。选育具有较高氮利用效率（nitrogen use efficiency，NUE）的耐低氮或氮高效利用作物品种，既可以降低氮肥施用量，也可以提高瘠薄土地的利用效率，是发展环境友好型农业的重要解决途径[4]。

中国南瓜（Cucurbita moschata）是葫芦科南瓜属一年生草本植物，在我国广泛栽培。中国南瓜起源于中南美洲地区，具有较强的抗逆能力[5-6]。中国南瓜也是黄瓜、甜瓜和西瓜等葫芦科作物的主要砧木之一。研究表明，采用中国南瓜为砧木嫁接甜瓜，氮利用效率提高1.3%～4.2%，果实氮素积累量和产量均显著提高[7]。中国南瓜嫁接黄瓜和西瓜也可明显促进盐胁迫下叶片和根系硝酸还原酶活性和氮素转化能力的提高，增强根际土壤酶活性，从而提高黄瓜和西瓜的耐盐性和产量[8-9]。因此，筛选中国南瓜耐低氮种质资源，对中国南瓜肉用及砧用品种选育均具有实际应用意义。

已有研究表明，不同种质资源的低氮耐受能力与自身基因型关系密切[10-12]，同时氮利用效率受到多种生理生化和代谢途径共同调控，少数几个性状不能准确反映出不同品种的耐受能力[13]。因此，有必要采用综合评价方法进行种质资源的评价与筛选。目前中国南瓜低氮耐受性研究主要集中于探讨不同生长指标在低氮处理前后的变化趋势，如南瓜根系长度、果实产量、植株氮利用效率等指标[14]，也有研究表明，氮肥施用量直接影响叶片总叶绿素含量、PSII活性等叶绿素荧光参数[15]，但尚未见中国南瓜氮利用效率鉴定评价方法的报道，因此有必要建立一套相对稳定且高效的中国南瓜低氮耐受性指标筛选评价体系。

笔者以8份中国南瓜种质资源为试验材料，利用水培法设置正常氮（7.0 mmol·L-1）和低氮胁迫（0.7 mmol·L-1）处理，进行18个生长和光合作用指标测定，并采用主成分分析和隶属函数分析法对种质低氮耐受性进行综合评价，建立适用于中国南瓜幼苗期低氮耐受性种质评价的实用性筛选鉴定体系，为中国南瓜耐低氮品种选育及氮高效利用基因的挖掘提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

8份中国南瓜种质均为中国农业科学院蔬菜花卉研究所南瓜育种课题组收集或育成的高代纯合自交系（表1）。

1.2 方法

试验于2022年8－9月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所人工气候室进行，培养温度为昼/夜=25 ℃/15 ℃（12 h/12 h）。选取颗粒饱满、种皮完整的种子播种于32孔穴盘，每份材料播种60粒，基质采用20目粗河砂，除正常浇水外，不添加其他措施，待其长至2叶1心时，挑选健壮且长势一致的幼苗移栽到水培盆中进行低氮胁迫。

试验采用Hogland营养液水培方式进行，低氮胁迫处理组的营养液氮浓度设置为0.7 mmol·L-1，对照组设置为7.0 mmol·L-1，其他条件保持一致。水培盆面积为1500 cm2 （50 cm × 30 cm），行间距为10 cm，每个水培盆间隔20 cm。使用小型通气泵对水培营养液进行加氧通气，每隔3 d通气1次，每次通气4 h。处理第0 天与第9天时测定植株生长指标和光合作用相关指标，设3次重复，每重复为5株幼苗。

1.2.1 水培营养液配制 对照组所施营养液为改良型Hogland营养液[16]：Ca（NO3）2·4H2O 2 mmol·L-1、KNO3 3 mmol·L-1、CaCl2 2 mmol·L-1、KCl 3 mmol·L-1、MgSO4·7H2O 2 mmol·L-1、NH4·H2PO4 1 mmol·L-1，并添加微量元素。低氮处理组所施营养液配方：Ca（NO3）2·4H2O 0.2 mmol·L-1、KNO3 0.3 mmol·L-1、CaCl2 3.8 mmol·L-1、KCl 4.7 mmol·L-1、MgSO4·7H2O 2 mmol·L-1、NH4·H2PO4 1 mmol·L-1，并添加微量元素。

微量元素配方：EDTA-NaFe 80 μmol·L-1、H3BO3 46.3 μmol·L-1、MnSO4·4H2O 9.5 μmol·L-1、ZnSO4·7H2O 0.8 μmol·L-1、CuSO4·5H2O 0.3 μmol·L-1、（NH4）6Mo7O24·4H2O 0.02 μmol·L-1。配方中不同氮浓度处理只改变硝态氮浓度，不改变铵态氮。

1.2.2 生长指标测定 利用刻度尺和游标卡尺测量植株的株高、茎粗；使用千分之一天平分别测定植株的地上部鲜质量和根部鲜质量，转入65 ℃烘箱烘72 h后测定地上部干质量及根部干质量；使用WinRHIZO根系扫描分析系统对植株根系进行扫描并测定根长、根直径、根尖数、根体积等根系指标。其他生长指标测定公式如下：

根冠比=根部鲜质量/地上部鲜质量； （1）

全株含水量/%=[1-（地上部干质量+根部干质量）/（地上部鲜质量+根部鲜质量）]×100； （2）

壮苗指数/%=茎粗×（地上部干质量+根部干质量）/株高×100； （3）

种质的低氮耐受系数γ=低氮处理组测定值/正常氮对照组测定值。 （4）

1.2.3 光合作用相关指标测定 参考邱喜岩等[17]的方法，利用分光光度法测定南瓜叶绿素含量。使用美国PP SYSTEMS CIRAS-3便携式光合仪测定植物的净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间CO2浓度（Ci）和蒸腾速率（Tr），测定光照度800 μmol·m-2·s-1，CO2浓度为400 μmol·mol-1，叶室温度为25 ℃，流速为500 μmol·s-1。

1.3 数据统计与分析

原始数据在Microsoft Excel 2010中计算，利用Matlab进行数据分析。采用皮尔逊相关系数进行相关性分析，主成分分析法进行主因子分析，最小二乘法估计线性回归参数。参考张蒙等[6]的方法进行隶属函数分析和综合评价。

2 结果与分析

2.1 低氮耐受系数的变异幅度及相关性分析

测定胁迫处理及对照组的各生长和生理指标，并计算每一单项指标的低氮耐受系数（表2）。结果表明，同一指标的低氮耐受系数在各种质之间变异范围较大，特别是根部鲜质量和根体积2个指标的变异系数分别达64%和67%，全株含水量的变异系数最小，仅为15%。

对各生长指标和光合指标的低氮耐受系数进行相关性分析，结果表明（表3），株高与茎粗呈极显著正相关，相关系数为0.92；根体积与地上部干质量（0.87）、根冠比（0.91）、壮苗指数（0.87）和根直径（0.86）均呈极显著正相关；气孔导度与蒸腾速率呈极显著正相关，相关系数为0.96；此外，根部干质量与地上部鲜质量（0.90）、根部鲜质量与根长（0.95），地上部干质量与壮苗指数（0.97）也均呈极显著正相关，说明各指标之间存在信息冗余，需采用主成分分析法进一步发掘各指标的内在相关性。

2.2 主成分分析

对各指标的低氮耐受系数先进行标准化，再进行主成分分析，确定4个综合指标的贡献率分别为61.3%、19.1%、11.7%和3.4%，累积贡献率达95.5%，表明这4个主成分可以代表18个初始测定指标胁迫耐受系数的大部分信息（表4）。其中，主成分1中，根部鲜质量、根体积的载荷值分别为0.609和0.474，此外，根部干质量、壮苗指数、地上部干质量的载荷值也分别达到0.296、0.287和0.279，表明低氮耐受性与植株全株生物量有关，特别是与根部生物量相关性更为明显；主成分2中，气孔导度和蒸腾速率的载荷值分别为0.476和0.590，表明其与植株叶片的水分利用效率密切相关；主成分3中，净光合速率的载荷值为0.798，表明其与植株叶片光合作用能力密切相关。以上结果表明，植株生物量和植株光合能力共同决定了中国南瓜苗期的低氮耐受性。

2.3 综合评价

2.3.1 隶属函数分析 为进一步明确4个综合指标对植株低氮耐受性的贡献率，采用隶属函数分析法进行综合评价。由表5可知，Cmo19隶属函数值U（X1）=1.00，说明该种质在综合指标1处表现的低氮耐受性最高，Cmo125隶属函数值U（X1）=0.00，说明该种质在综合指标1处表现的胁迫耐受性最低。计算各种质在4个综合指标处的综合评价值D（表5）。8个中国南瓜种质综合评价值D的平均值为0.59，其中综合评价值D较高的是Cmo19（0.84）、Cmo8（0.83），表明其低氮耐受性较高，综合评价值D较低的是Cmo125（0.31）和Cmo171（0.30），表明这2份种质的低氮耐受性较低。

2.3.2 回归分析 以D值为因变量、各单项指标的胁迫耐受系数为自变量进行回归分析，从中筛选出根部鲜质量（X1）、根体积（X2）、根部干质量（X3）、壮苗指数（X4）等4个指标，建立低氮耐受性评价的回归方程：D’=0.950 9-0.121 2X1-0.207 7X2+0.134 1X3-0.078 2X4，R2=0.957。利用该回归方程对8份种质进行回归预测综合评价值D’，平均估算精度为96.5%，与实际计算综合评价值D基本一致（表5）。该回归分析表明，根部鲜质量、根体积、根部干质量、壮苗指数等4个指标对中国南瓜幼苗低氮耐受性的影响更为显著。

3 讨论与结论

评价指标的选择对作物氮高效利用评价效率至关重要。笔者以低氮和正常氮栽培条件下的中国南瓜为试材，对18个生长和光合作用相关指标进行综合分析，发现根部鲜质量、根体积、根部干质量等根系生长指标在综合评价中起到更为重要的作用。前人研究结果表明，选择对氮素吸收和利用效率贡献较大的指标作为氮高效利用作物筛选的评价指标是可行的[18-20]。相关学者已提出很多评价指标来证明作物的氮效率是通过吸收效率和利用效率两个方面来实现的，其中氮素相对积累量和氮素生理利用效率两个评价指标最为直接[21]。由于氮素的测定需要专用仪器，且测定过程复杂，大多数学者认为形态指标作为氮高效基因型评价指标，最好的指标是生物量 [22-26]。笔者以根系生长指标作为主要评价指标，通过隶属函数和逐层回归法建立的中国南瓜低氮耐受性预测方程，具有易操作、鉴定效率高等优点，适用于中国南瓜种质的田间高通量筛选工作，具有一定的实际应用价值。

光合作用参数也是评价氮利用效率的重要指标之一。石嘉琦等 [27]研究认为，黄瓜叶片叶绿素相对含量（SPAD）、净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、蒸腾速率（Tr）等光合作用参数，可以作为评价黄瓜施氮量的重要参考指标之一。西瓜幼苗叶片初始荧光（Fo）、PSII（Fv/Fo）、PSII实际光化学量子产量（ΦPSⅡ）均显著受到施氮浓度的影响，进而影响植株生长和光合效率[28]。以中国南瓜为砧木嫁接西瓜，在低氮处理下，氮的吸收和利用效率以及接穗叶片栅栏和海绵状薄壁组织厚度、叶绿素含量相比于未嫁接品种均显著升高，表明中国南瓜氮吸收效率与光合作用之间存在密切的关系[29]。笔者选用的光合作用相关指标主要关注了总叶绿素含量、Pn、Gs、Tr等指标，通过降维分析明确了气孔导度（Gs）和蒸腾速率（Tr）这2个指标在中国南瓜低氮耐受性评价中贡献率相对较高，可以作为表征光合作用强度的重要参考。植物叶片的气孔导度和蒸腾速率与植株水分运输、代谢及水分利用效率密切相关，而近年来葫芦科作物设施栽培条件下的水氮耦合机制等相关研究已经引起了广泛关注，进一步说明中国南瓜低氮耐受性相关研究应综合考虑水分利用效率和氮利用效率的共同影响[30-31]，未来可关注中国南瓜水氮协同利用效率对植株生长、光合作用及产量影响方面的研究。

综上所述，不同中国南瓜种质生长和光合作用相关指标的低氮耐受系数存在显著差异，根部干质量、根部鲜质量、根体积、壮苗指数等4个指标可作为低氮耐受性鉴定指标，筛选出1份苗期低氮耐受性较强的种质Cmo19（柿饼南瓜）。笔者提出了一种基于Hogland营养液水培法的中国南瓜幼苗期低氮耐受性种质资源的快速筛选鉴定方法，其与田间实际生产中的中国南瓜耐氮能力鉴定评价的相关性尚有待进一步验证。今后可以继续深入挖掘水氮利用效率的动态平衡对中国南瓜植株光合作用及植株生长的调控机制，以期为指导中国南瓜耐低氮种质的选育和田间生产提供理论依据。

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