明小花蝽卵黄原蛋白的鉴定及表达分析

摘要：本研究对明小花蝽Orius nagaii的卵黄原蛋白（vitellogenin，vg）进行结构分析、原核表达、抗体制备以及时空动态表达分析，旨在为昆虫卵黄原蛋白的研究提供理论依据。用RACE方法克隆出OnVg基因全长，运用生物信息网站分析OnVg蛋白得出其具有3个保守结构域：脂蛋白N端结构域、未知功能结构域以及血管性血友病因子结构域。构建On Vg的原核表达载体pET-32a-c（+）-OnVg，转至大肠杆菌进行诱导表达，通过免疫昆明小鼠制备了anti-OnVg抗体。Western blot结果显示anti-OnVg抗体与OnVg蛋白能够特异性结合。qPCR检测vg基因在明小花蝽若虫、成虫阶段和成虫不同组织中的时空动态表达，结果表明vg基因在若虫阶段最低，成虫阶段表达量升高且3d时表达水平达到最高：成虫腹部表达量最高，其次是肠道和卵巢。本研究结果可为探究明小花蝽的生殖调控机理提供理论支持。

关键词：明小花蝽：卵黄原蛋白：原核表达：抗体制备；时空表达

中图分类号：S476.2：Q786 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2024） 08-0137-09

小花蝽（Orius spp.）属半翅目花蝽科，原产于亚洲，目前在世界各国均有分布。作为一类重要的广食性捕食性天敌昆虫，小花蝽被广泛应用于防治田间及温室中的蚜虫、蓟马、螨类等多种小型害虫以及部分鳞翅目害虫。明小花蝽（Orius nagaii）隶属小花蝽属，目前仅有少量关于其分布和内生共生菌的报道，其饲养技术、生物学、生理学及防害应用等方面还未见报道。通过室内饲养明小花蝽，发现其适应能力强、产卵量高，且易于在室内大量扩繁，极具商业化饲养潜力。

卵黄原蛋白（vitellogenin，vg）是一种脂肪体细胞蛋白，其表达受性别、组织以及生长历期调控。在雌性成虫脂肪体中，vg被特异性合成，随后经过切割、糖基化和磷酸化等一系列过程，最终释放到血腔中，通过受体介导的内吞作用被卵巢摄取，在卵巢内被进一步修饰形成并发育成卵子。雌性昆虫的生殖过程受保幼激素和蜕皮激素调控，vg是主要分子靶点，但是不同昆虫受激素调节存在差异，例如蜜蜂、果蝇受蜕皮激素调控，黏虫受保幼激素调控，而斜纹夜蛾受蜕皮激素和保幼激素共同调控。

国内有关小花蝽的报道更多是关于捕食功能反应、毒性试验、营养物质选择等领域，对其繁殖关键因子的分子生物学基础研究甚少。本研究利用转录组数据获取vg基因cDNA片段，采用RACE技术克隆明小花蝽vg基因全长，运用生物信息学网站分析明小花蝽vg蛋白基因（OnVg）结构特征，构建pET-32a-c（+）-OnVg原核表达载体，并制备蛋白特异性抗体，通过荧光定量PCR分析vg基因在明小花蝽若虫、成虫阶段，以及成虫头、胸、腹、卵巢、肠道组织中的表达模式，为进一步研究OnVg的功能及其在生殖中的作用机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

明小花蝽来自山东省农业科学院天敌昆虫实验室，试验开始于2022年2月。饲养条件：温度（26±1）℃，湿度（60+5）%，光照周期L：D=16 h：8h，以芸豆和米蛾卵喂养。

1.2 Vg蛋白的结构分析

使用NovoPro（https： //www. novopro. cn/tools/tmhmm. html）网站的在线工具进行蛋白质信号肽预测；使用EMBL（http：//smart. embl- heidelberg.de/）中的SMART程序鉴定其功能结构域：使用DNAMAN 6.0.3.99中文版翻译成氨基酸序列。

1.3 引物设计

使用Primer3Plus（https：//www. primer3plus.com/index.html）网站设计引物（表1）。RACE试验委托上海植硕生物科技有限公司完成，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 明小花蝽vg基因全长克隆

1.4.1 核心片段扩增

取约20 mg明小花蝽置于2 mL的离心管中，放于液氮中冷冻研磨，使用Tr-izol法提取总RNA。通过转录组数据，利用核心引物OnVg-f/OnVg-r（表1），对提取的总RNA进行RT-PCR。对扩增产物进行测序，按照Vazyme的phanta max fidelity DNA polymerase说明书获得核心序列。

1.4.2 5’/3 'RACE克隆基因全长

根据核心序列设计RACE引物并进行5'RACE和3'RACE。5'RACE依照5’/3'RACE Kit，2nd Generation（Roche）说明书，使用引物Vg-5' RACE -rt-r进行反转录；得到的cDNA经引物Vg-5 'RACE-rl和Oligo dT-Anchor Primer（Vial 8）进行第一轮PCR;以第一轮PCR产物为模板使用引物Vg-5' RACE-r2和PCR Anchor Primer（Vial 9）进行第二轮巢式PCR0 3'RACE依照3'Full RACE Core Kit（Taka-ra）说明书，使用Vg-3' RACE-fl引物和3'RACEOuter Primer进行第一轮PCR;以第一轮PCR产物为模板，使用引物Vg-3'RACE-f2和3'RACEControl Inner Primer进行第二轮嵌套PCR。PCR产物经纯化，送至生工进行测序，将5' RACE、核心序列及3'RACE拼接在一起，得到OnVg cDNA的全长序列。

1.5 PCR扩增

提取明小花蝽总RNA，使用PrimeScript RTreagent Kit（TaKaRa）反转录合成cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增，参考祝晴、李佳鹏等的扩增体系和反应程序，其中上、下游引物On-Vg-1 F/R和OnVg - 2F/R各2μL，cDNA模板1μL；反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30-35个循环；72℃延伸10 min。PCR结束后电泳检测目的条带（960 bp）。

1.6 重组表达载体的构建

按照胶回收试剂盒（北京聚合美生物科技有限公司）的使用说明，将正确的凝胶条带回收纯化。将回收产物与pET-32a-c（+）（Novagen）载体分别用限制性内切酶BamH I（Thermo）、NotI（Thermo）进行双酶切。利用T4连接酶（TaKaRa）进行连接，构成重组表达载体，转化大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素（Ampr）抗性的LB固体培养基上，于37℃培养箱培养13 - 16 h后挑取菌落。将单菌落置于1.5 mL离心管中（离心管中放人500 μL含Ampr的LB液体培养基），37℃、220 r/min摇床振荡培养12 -14 h后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，以获得含目的基因的重组载体pET-32a-c（+）-OnVg。

1.7 Vg蛋白诱导表达

取2 μL测序正确的pET-32a-c（+）-OnVg重组质粒转化到E．coli BL21感受态细胞（天根生化科技有限公司）中，培养在含Ampr的LB固体培养基上，37℃高速振荡12 -14 h后观察并挑取菌落。将单菌落悬浮于15mL离心管（离心管中放人3 mL含Ampr的LB液体培养基），37℃、220 r／min振荡培养12 - 16 h，菌液浑浊后转入100 mL液体培养基扩大培养。后续菌液OD00。值在0.6左右时，加入1mg/mL IPTG（索莱宝）进行诱导，37℃、150 r/min摇5-6 h后，8 000 r／min低温离心10- 12 min收集菌体。

收集未诱导与诱导样品菌体，加5 mL细胞裂解液（CLB：GLPBLO为99：1），经超声波破碎，于10 000 r/min、4℃离心10- 12 min后收集上清和沉淀，1×SDS - PAGE蛋白上样缓冲液与上清1：1混合，2xSDS-PAGE蛋白上样缓冲液与沉淀按照2：1混合，振荡仪充分振荡后，于100℃沸水中变性5 min，进行聚丙烯酰氨凝胶电泳检测。检测合格后分装，- 80℃保存，用于后续的抗体制备。

1.8 Western blot

将免疫印记膜用甲醇处理约15 s，按照三明治结构方法（滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸），60 V或300mA转膜3h。参考祝晴、李佳鹏等的方法进行奶粉封闭、一抗和二抗孵育，使用His标签抗体和anti- OnVg血清抗体进行蛋白检测。

1.9 Vg抗体制备

将正确的重组蛋白胶条研磨，用O.go-/o生理盐水稀释。昆明小鼠提前喂养2-3 d，每只20 9左右。用1 mL针管注射300 - 400 μL稀释液到小鼠腹腔，每周注射一次，持续4周。第5周眼球取血至1.5 mL离心管，37℃水浴1h，4℃冰箱放置6h后，12 000 r/min、4℃离心13 - 15 min，取上清，置于液氮冷冻至发白状态后放入-800C冻存，或用血清加60％甘油稀释后-20℃冰箱保存。

1.10 明小花蝽卵巢蛋白提取

将羽化3d后的明小花蝽置于PBS中进行卵巢解剖，提取蛋白。研磨液制备：蛋白裂解液（RI-PA）200 μL、磷酸酶抑制剂4μL、1×蛋白酶抑制剂2 μL、100x PMSF 2μL混合在一起，所有试剂配制在冰上操作。明小花蝽卵巢（n≥40）中加入200 μL研磨液进行研磨，放人冰盒静置30min，12 000 r/min、4℃离心5- 10 min，取上清液；上清液与蛋白上样缓冲液4：1混合，100℃金属浴5min。

1.11 OnVg基因的时空表达

分别取卵、1-5龄若虫和羽化1、3、5、7、9、10d的雌成虫（n≥35），及羽化后12-24 h雌成虫的头、胸、腹、卵巢、肠道组织（n≥40）。提取总RNA，并进行反转录，而后以cDNA为模板，Actin为内参，引物见表1，使用思科捷2x SYBR GreenqPCR Mix（With ROX）试验盒检测OnVg的相对表达。qPCR反应体系20 μL：上、下游引物各0.4μL，ddH2O 6.8 μL，cDNA模板2μL（cDNA稀释10倍），2x SYBR qPCR Mix 10 μL， ROX ReferenceDyeⅡ0.4 μL。反应程序（二步法）：95℃预变性20 s;90℃变性3s，60℃退火30 s，共40个循环。每个处理组进行3次生物学重复，4个技术重复。结果用2-△△Ct法计算基因的相对表达量。

1.12 数据分析

使用PASW Statistics 18软件（SPSS Inc.，Chi-cago．IL，USA）进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 OnVg基因的核心片段及基因全长

根据已知序列，设计了核心序列引物，进行核心片段扩增，开放阅读框长5 973 bp（图1A）。基因特异引物5'RACE-r1和5'RACE-r2分别与试剂盒自带引物进行第一轮、第二轮5'RACE试验。通过第一轮PCR得到了弥散条带（图IB，条带2），以第一轮PCR扩增产物为模板，进行第二轮巢式PCR，得到一条清晰的条带（图1B，条带3）。3'RACE步骤同上，进行第二轮巢式PCR，得到一条清晰的条带（图1C）。

2.2 OnVg基因序列分析

OnVg基因cDNA全长6 133 bp，其中开放阅读框长5 973 bp，翻译成1 990个氨基酸，去掉信号肽，约219.33 kDa，包含3个保守结构域：脂蛋白N端结构域（LPD_N）、未知功能结构域（un-known functuin，DUF1943）以及血管性血友病因子结构域（von Willebrand factor type D domain．vWD）。选取灰色阴影部分960 bp碱基（图2），杜会玲，等：明小花蝽卵黄原蛋白的鉴定及表达分析约32 kDa，进行PCR克隆及测序。对序列进行位点切割，切割位点RSRR将其分解成大、小两个亚基，预测大亚基为173.74 kDa，不含信号肽的小亚基为41.69 kDa。结果表明，PCR扩增序列长度正确，无突变碱基（图3）。

2.3 原核表达载体的构建和鉴定

将OnVg扩增片段与pET-32a-c（+）载体经带有酶切位点的引物PCR扩增（图4），构建重组表达载体pET-32a-c（+）-OnVg。利用通用引物经PCR和双酶切鉴定，得到的片段大小基本符合预期（图5），表明载体构建成功，可用于诱导表达重组蛋白。

2.4 重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达

将诱导和未诱导的上清和沉淀分别进行聚丙烯酰胺蛋白电泳检测，Bradford法染色后发现，pET-32a-c（+）-OnVg的重组质粒大小在55 kDa左右（图6），为图2灰色阴影部分蛋白分子量32kDa加上载体修饰，目的蛋白主要以沉淀形式表达，在上清中表达不明显。Western blot结果（图7）显示，目的蛋白与His抗体能够很好地结合，55kDa处的条带与预期大小一致，证明重组蛋白正确表达。

2.5 抗体制备与检测

将重组蛋白经切胶研磨后配制成生理盐水稀释液，注射到昆明小鼠体内，5周后收集血清，检测血清抗体anti- OnVg。用稀释5 000倍的血清对诱导样品进行检测，结果（图8）条带单一且清晰，与预期相符，可满足免疫组化和Western blot试验的要求。用anti-OnVg血清抗体检测明小花蝽卵巢蛋白样品，结果（图9）显示，在抗体稀释5 000倍时，蛋白条带清晰，符合预测的蛋白分子量173.74 kDa。

2.6 OnVg序列时空动态表达

以Actin为内参，qPCR检测OnVg基因在明小花蝽若虫阶段、成虫阶段和雌成虫不同组织部位的动态表达模式，表明OnVg在不同发育阶段和成虫不同组织中的表达均有波动。其在成虫腹部相对表达水平最高，其次是肠道和卵巢，在胸部和头部的表达水平最低（图10A）。整个若虫阶段OnVg的表达水平较低且各阶段间无显著差异；成虫阶段表达水平变化较大，3d时达到高峰，7d时降至最低，后再次上升，但显著低于3d时（图10B）。

3 讨论与结论

卵黄原蛋白可以向胚胎提供多种营养物质，供其发育产卵，例如各种氨基酸、磷、脂质、碳水化合物、维生素等。在绝大多数昆虫中，vg是由约6 000-7 000 bp碱基编码的约220 kDa的大分子膜蛋白，大亚基（140 - 190 kDa）和小亚基（40-60 kDa） -般在分泌到血腔前被切割，大亚基往往输送至卵巢。根据氨基酸序列分析，昆虫Vg十分保守，有3个保守结构域：位于N端的卵黄原蛋白N端结构域（vitellogenin N domain，VitN）、中间区域的未知功能结构域以及位于C端的血管性血友病因子结构域：在N端有一个多聚丝氨酸区域，其具体功能尚不清楚，需要进一步研究。

通过对明小花蝽Vg基因序列的分析发现，其总长6 133 bp，编码1 990个氨基酸，去掉信号肽，分子量为219.33 kDa左右。本研究用于原核表达的Vg肽链N区是一个脂蛋白结构域，主要用于脂质运输，表达的vg重组蛋白为55 kDa左右，理论上用Vg重组蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体对Vg大、小亚基都应有免疫反应，但Western blot结果显示在明小花蝽雌虫卵巢中，只检测出vg的大亚基（173.74 kDa左右），在RSRR进行位点切割，结果符合预测的大亚基的蛋白分子量。相关研究表明，斜纹夜蛾Vg抗体在卵与雌性血淋巴中进行蛋白印迹分析检测出vg的大亚基；甜菜夜蛾vg多克隆抗体在雌虫血淋巴中只检测出vg的大亚基（180 kD左右）；在一些高等膜翅目昆虫如日本瘤姬蜂（Pimpla nipponi-0ca）中也得到类似结果。甜菜夜蛾vg中只有编码大亚基的部分才有转录活性，而编码小亚基的部分缺失。

vg具有传统的蛋白前体功能，还与昆虫免疫反应等有关。研究表明，昆虫vg的表达在不同发育阶段具有很大差异，成虫阶段表达量最高。粘虫VgR表达量在羽化后Sd最高，黑尾叶蝉在羽化后16 d达到VgR高峰值，草地贪夜蛾vg基因表达量在成虫羽化4d达到峰值。本研究OnVg基因的表达情况与上述研究相符，都是在成虫阶段表达量最高，随着羽化时间延长，呈先上升后下降的趋势。卵巢是昆虫重要的生殖器官，具有调控生殖发育、参与免疫应答等功能。昆虫不同组织中vg的表达量存在差异，番茄潜叶蛾VgR基因在雌虫卵巢高度表达，草地贪夜蛾vg在雌虫脂肪体高度表达，大草岭雄虫vg基因在腹部的表达量较高。对组织部位的研究结果表明，OnVg基因在明小花蝽雌虫腹部高表达，其次是肠道和卵巢，进一步说明Vg与卵黄发生密切相关。下一步应着重研究Vg对明小花蝽发育的影响，探究其分子调控机制，如产卵量、羽化率、产卵前期、RNA干扰、糖代谢、脂代谢等。

本研究通过构建重组质粒并免疫小鼠，成功制备了anti-Vg血清抗体，可以特异性识别明小花蝽的vg蛋白，同时研究了OnVg基因在不同组织和发育阶段的时空表达情况，所得结果为进一步探究明小花蝽Vg的功能及生殖调控机理奠定了基础，可为明小花蝽商品化繁育提供新的途径。

基金项目：济南市农业应用技术创新项目（CX202201）；山东省科技型中小企业创新能力提升工程项目（2023TSGC0709）