利用抗坏血酸过氧化物酶揭示生防放线菌XFS-4对大豆胞囊线虫的抗性

项鹏　杨树　李宝华　李艳杰　李红鹏　鹿文成　栗铭徽　张武

摘要：于2021年在黑龙江省黑河市从大豆根际土壤中分离获得1株对大豆胞囊线虫具有较高活性的放线菌 XFS-4，为了解该生防放线菌XFS-4对大豆胞囊线虫的作用机理，以黑河市主栽大豆品种黑河43为试材，用 XFS-4 发酵液做种子包衣处理，盆栽条件下人工接种大豆胞囊线虫，以未接种作对照，接种后 4、7、11、14 d取样，测定大豆叶内抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性变化。同时，以抗坏血酸过氧化物酶基因序列设计引物，利用RT-PCR技术，分析该基因在菌株XFS-4包衣黑河43后抗大豆胞囊线虫过程中的表达差异，从基因转录表达水平上对大豆抗坏血酸过氧化物酶基因（Gm-Apx）进行研究，以发现该基因与大豆胞囊线虫（SCN）抗性之间的关系。结果表明，XFS-4包衣黑河43接种大豆胞囊线虫4、7 d后，APX活性明显高于对照，接种条件下的黑河43 APX活性随大豆生长一直升高。在接种大豆胞囊线虫后，其菌株XFS-4包衣黑河43处理组中，Gm-Apx相对表达量在接种后4、7 d表达上调，而在接种11、14 d表达下调，说明该基因参与了大豆早期防御胞囊线虫的侵染过程，对植物抗性反应及解除胁迫诱导的氧化损害起了很重要的作用。

关键词：放线菌；大豆胞囊线虫；抗坏血酸过氧化物酶；RT-PCR

中图分类号：S435.651文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2024）09-0159-06

大豆胞囊线虫（SCN）是大豆根部病害之一，被认为是造成大豆减产的主要原因，可导致大面积减产，危害十分严重［1-2］。在我国可造成1.2亿元的经济损失［3］，在全球范围内损失约为15亿美元［4］。黑龙江省黑河市是我国大豆主产区，2022年大豆播种面积达143.86万hm2［5］，大豆胞囊线虫对当前大豆的安全生产构成了严重威胁，一般发病田减产10%～20%，严重时可达30%～50%，在开花前后发生可引起死苗甚至造成绝产［6］。

为振兴我国大豆产业，2019年3月，国家启动了“大豆振兴计划”，主要目标是“一扩两提”，其中：“扩”就是扩大面积，力争到2022年全国大豆种植面积达到933.33万hm2；“提”就是提高单位面积产量、提升品质，力争到2022年全国大豆平均产量达到135 kg/667 m2［7］。有效防控大豆胞囊线虫危害，减少损失，提单位面积产量、提品质是大豆振兴计划的重要环节。

黑龙江省农业科学院黑河分院植保室在前期工作中，从大豆根际土壤中分离获得1株对大豆胞囊线虫具有较高活性的放线菌XFS-4，包衣处理后对苗期大豆第一代大豆胞囊线虫抑制率达到59.77%，经形态学特征、生理生化试验测定及16S rDNA序列同源性分析，确定该菌株为沙阿霉素链霉菌［8］。为了解生防放线菌XFS-4对大豆胞囊线虫的作用机理，本研究以合成关键酶抗坏血酸过氧化物酶基因序列设计引物，大豆黑河43和菌株 XFS-4 为试材，利用酶活测定和RT-PCR分析菌株XFS-4包衣黑河43后，在接种大豆胞囊线虫前后抗坏血酸过氧化物酶活性的变化和基因表达量的变化，初步明确菌株XFS-4对大豆胞囊线虫抗性过程中抗坏血酸过氧化物酶的作用。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试大豆品种黑河43号由黑龙江省农业科学院黑河分院提供；供试生防菌株XFS-4保存于黑龙江省农业科学院黑河分院植保室；供试大豆胞囊线虫3号生理小种取自笔者研究室试验基地。

1.2 菌株发酵液的制备

将保存好的菌株XFS-4接种在高氏一号平面培养基上，28 ℃恒温培养箱培养5 d。将平板上培养好的菌落接种于马铃薯液体培养基中，28 ℃、150 r/min 三角瓶振荡培养7d后过滤，获得发酵液，发酵液置于4 ℃冰箱中备用［9］。

1.3 种子处理方法

用5% NaClO溶液对大豆种子进行表面消毒，再用无菌水冲洗5次。用制备好的发酵液按1%的种子量进行种子包衣处理，待干燥后装袋、编号备用［10］。

1.4 大豆胞囊线虫的制备

采用改良淘洗-过筛法从采取的土样中分离胞囊，在体视镜下挑取新鲜、饱满、成熟、均一的胞囊。胞囊先用0.5%NaClO溶液进行消毒，再用无菌水冲洗5次，置于28 ℃恒温培养箱进行孵化，将孵化后得到的2龄幼虫制备成200条/mL的悬浮液［11］。

1.5 大豆材料的播种与接种

将XFS-4发酵液包衣好的黑河43种子播种在16 cm×16 cm的黑色塑料钵中，钵中装有灭菌沙土（50%细沙，50%有机土壤），以未包衣的黑河43作对照。当幼苗长出2张子叶时，将制备好的2龄幼虫悬浮液进行接种，每株接种10 mL，以无菌水接种作对照。

1.6 取样方法

分别在接种4、7、11、14 d后取样，处理组和对照组分别取长势一致的幼苗3株，用自来水快速冲洗叶部，再用蒸馏水洗净，滤纸吸干后，记录好处理、对照标签分别放入收集袋中，液氮冷冻，-80 ℃保存。每个处理3次独立的重复。

1.7 酶粗提液的提取

提取缓冲液为50 mmol/L pH值7.8磷酸缓冲液（内含2 mmol/L AsA和5 mmol/L EDTA）。参照沈文飚等的方法［12］提取。称取1.0 g大豆叶片样品放入研钵中，加入2.0 mL提取缓冲液和少量石英砂充分研磨，用3.0 mL上述提取缓冲液冲洗研钵和研柞，将冲洗液和匀浆一起转入离心管中。4 ℃、12 000 r/min 离心20 min，上清液即为酶粗提液。将酶粗提液放入冰箱中-20 ℃保存，待测定酶活。

1.8 抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定

测定反应液为50 mmol/L pH值7.0磷酸缓冲液（内含0.5 mmol/L AsA、0.1 mmol/L H2O2和 0.1 mmol/L EDTA-Na2）。参照沈文飚等的方法［12］测定。室温下1 min 1 g鲜质量氧化1 μmol ASA的酶量作为1个酶活性单位（U），酶活力以D290 nm/（min·g） FW表示。

APX活性（U/g FW）=（（ΔD290 nm×提取液体积（mL））/（样品质量（g）×加酶体积（mL） ×t（min）））。

1.9 抗坏血酸过氧化物酶（APX）基因表达量分析

1.9.1 总RNA的提取与反转录

按照试剂盒说明书进行总RNA的提取，RNA D260 nm/D280 nm 值在 2.0～2.2的范围内。将1 μg总RNA 加入微量离心管中并于70 ℃温育10 min，短暂离心后置于冰上，加入试剂建立一个20 μL的反应体系，将反应体系置于42 ℃温育60 min、95 ℃加热5 min、5 ℃放置 5 min。

1.9.2 引物设计

APX基因在GeneBank的登录号为NM_001251432.2，根据该序列利用Primer Premier 5.0软件设计引物，上游引物为5′-GGTGCTGTAGGAGTTGTAG-3′，下游引物为5′-AAAGTCTGAATGGCTGTG-3′，基因片段为216 bp。内参基因上游引物为5′-ATCTTGACTGAGCGTGGTTATTCC-3′，下游引物为5′-GCTGGTCCTGGCTGTCTCC-3′，基因片段为126 bp。引物合成由哈尔滨生工生物工程技术有限公司完成。

1.9.3 PCR反应条件

APX基因：95 ℃预变性 3 min，95 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，72 ℃充分延伸10 min。

1.9.4 RT-PCR反应条件

95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min（荧光采集1次），95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。进行Real-time PCR反应时，为了尽可能减少因加样引起的处理间及重复间的误差，根据试验要求尽可能先混合样品再分装。每个样品的相对表达量的值等于目的基因的表达量均值减去内参基因的表达量均值，应用比较CT值法（2-ΔΔCT）进行基因表达的相对定量计算和统计分析。

2 结果与分析

2.1 菌株XFS-4接种大豆胞囊线虫后根内抗坏血酸过氧化物酶的变化

从图1可以看出，在接种SCN情况下，菌株XFS-4包衣黑河43的APX活性高于对照，随大豆生长呈先升高后下降趋势。接种条件下的黑河43，其APX活性随大豆生长一直升高，说明植株在线虫的侵染下，APX活性持续升高防御植物细胞外界氧化胁迫，而XFS-4包衣后的黑河43在7 d后开始下降。所以，抗坏血酸过氧化物酶的活性变化在XFS-4处理大豆抗大豆胞囊线虫的过程中起重要作用。

2.2 样品RNA的提取

取大豆样品1 μL 总RNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳后，可以清晰分辨28S rRNA和18S rRNA，紫外分光光度计测得浓度较好，符合进一步RT-PCR的要求（图2）。

2.3 PCR扩增结果

通过凝胶电泳分析PCR产物的特异性（图3至图6），Gm-Apx基因和Gm-Actin基因的凝胶电泳结果都仅有1条电泳条带，均得到特异性扩增目的产物。其中A1-H3和I1-P3是指16个处理3次重复，共48个上样样品。

2.4 对PCR扩增产物测序

将得到的PCR产物进行测序，得到216 bp的片段，经过BLAST比对分析表明，与已报道序列NM_001251432具有高同源性，相似度100%。结果如下：5′-GGTGCTGTAGGAGTTGTAGTTACTGCCGCAGTGGTGATCATCAGTTACTTGTATGAAGTTCGCAAAAGAGGGAAGTAAACTGGACTTGTTCATTTCACTTGGCTGTTACGTTTGCGTGACCCTGACCCATAATGTGAAAACAGGGTTCATTTTTGCAGCTTCAGATTCTGTTTACTTAGTACCAATAAAGAATAATGCCACAGCCATTCAGACTTT

-3′。

2.5 Gm-Apx和Gm-Actin基因的荧光定量曲线分析

通过对试验中涉及的主要参数分析，目的基因的扩增曲线为标准的“S”形，熔解曲线的峰型单一（图7、图8），内参基因的扩增曲线为标准的“S”形，溶解曲线的峰型单一（图9、图10），说明样品的质量较高，引物的特异性较好，无引物二聚体及非特异性扩增产物，内参基因和目的基因的Tm值分别为84.5、83.5 ℃。

2.6 Gm-Apx基因的相对定量表达分析

综合分析Real-time PCR的结果，大豆根内Gm-Apx基因响应SCN的侵染，在各处理中响应的方式相似，接种前后的同期样本中该基因的相对表达量差值整体上均出现先上调后下降的趋势，但表达效率不同。在接种无菌水4、7、11、14 d后，Gm-Apx基因在菌株XFS-4包衣黑河43处理组中的相对表达量分别为黑河43对照中表达量的0.79、0.85、0.51、0.97倍（图11），即菌株XFS-4包衣的黑河43在未接种线虫的情况下，其Gm-Apx的表达下调。

Gm-Apx在接种大豆胞囊线虫侵染后的4、7、11、14 d，其菌株XFS-4包衣黑河43处理组中相对表达量分别为黑河43对照中表达量的1.46、1.08、0.87、0.92倍（图12），即在接种后4、7 d表达上调，而在接种11、14 d表达下调，说明该基因受到线虫侵染的诱导表达，参与了大豆早期防御胞囊线虫的侵染过程。

3 讨论与结论

抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）是降解过氧化氢的关键酶，能提高植物体内抗氧化酶活性和增强抗氧化代谢的水平，是提高植物抗逆性的有效途径之一。近年来，关于APX基因功能的研究主要集中在植物抗逆方面，目前多种植物的APX基因在诱导抗性方面的作用已有报道。在非生物胁迫条件下，水稻、白桦中APX基因表达上调［13-14］。Park等在甘薯中成功克隆到swAPX1基因，研究发现swAPX1基因在受到外界非生物胁迫时，其表达量均明显升高，说明了swAPX1基因在清除甘薯叶片中的过氧化氢方面发挥了重要作用，从而有利于植株克服非生物和生物胁迫造成的氧化损伤［15］。Shi等研究发现，在高温条件下，转大麦APX基因的拟南芥叶片正常，而非转基因拟南芥的叶片出现大量枯黄［16］。Kornyeyev等获得了转叶绿体APX基因的棉花植株，APX在植物体内过量表达，其叶片中APX活性比野生型的提高5倍［17］。Caldwell等研究大豆cAPXs中观察到，APX的转录、翻译和翻译后调控可增强大豆抵抗环境胁迫的能力［18］。Sarowar等将辣椒APX基因转入烟草，同样提高了转基因烟草的抗氧化胁迫与抗真菌能力［19］。Li等向烟草中转入过氧化物酶体APX基因，提高了转基因烟草的抗旱耐盐能力［20］。Yabuta等研究表明，在转基因烟草中，叶绿体APX在清除活性氧体系中发挥着很重要的作用，它保证了叶片的叶组织在水循环和光合作用中维持能量［21］。方涛等以OsApx7和OsApx8突变本为材料，证实了水稻叶绿体APX，特别是APX8，在水稻对抗干旱的逆境中发挥着重要的作用［22］。邵振启等以水稻抗坏血酸过氧化物酶基因OsApx2为转化对象，获得转OsApx2大豆，抗坏血酸过氧化物酶活性等干旱指标及产量相关性状测定表明OsApx2超表达能够显著提高大豆的耐旱性［23］。

本研究利用实时荧光定量PCR技术，分析了Gm-Apx基因在菌株XFS-4包衣黑河43后抗大豆胞囊线虫过程中的表达差异，从基因转录表达水平上对Gm-Apx进行研究，以发现该基因与SCN抗性之间的关系。综合分析Real-time PCR的结果，在接种线虫后，菌株XFS-4包衣的黑河43在4、7 d 时，Gm-Apx基因的表达呈上升趋势，分别为对照的1.46、1.08倍，这表明在接种后的前期，由于线虫的入侵，造成寄主细胞破坏，诱导了胞内 H2O2 的增加，继而导致了Gm-Apx基因表达上调；接种后11、14 d，Gm-Apx表达下降，分别为对照的0.87、0.92倍。这可能一方面是 H2O2 浓度下降，另一方面由于活性氧对植物自身具有一定的损害作用，植物自身启动了限制活性氧生成的机制。试验结果表明，大豆在受到线虫侵染时，菌株XFS-4能够诱导Gm-Apx的表达，对植物抗性反应及解除胁迫诱导的氧化损害起了很重要的作用。

参考文献：

［1］Allen T W，Bradley C A，Sisson A J，et al. Soybean yield loss estimates due to diseases in the United States and Ontario，Canada，from 2010 to 2014［J］. Plant Health Progress，2017，18（1）：19-27.

［2］Kim D，Choi I，Han W，et al. Studies on HG type of Heterodera glycines in Korea［J］. Research in Plant Disease，2013，19（1）：31-35.

［3］Moens M，Li Y，Ou S Q，et al. Identification of Heterodera glycines using PCR with sequence characterised amplified region （SCAR） primers［J］. Nematology，2008，10（3）：397-403.

［4］Hosseini P，Matthews B F.Regulatory interplay between soybean root and soybean cyst nematode during a resistant and susceptible reaction［J］. BMC Plant Biology，2014，14：300.

［5］ 黑河市人民政府. 增面积 育良种 延链条——黑龙江黑河大豆产业发展调查［EB/OL］. （2022-09-15）［2023-03-30］. http：//www.heihe.gov.cn/hhs/c100749/202209/c11_211788.shtml.

［6］项 鹏. 黑河地区大豆胞囊线虫病研究现状［J］. 黑龙江农业科学，2020（8）：113-115.

［7］曾小艳，祁华清，邓 义，等. 农业农村部《大豆振兴计划实施方案》解读［J］. 农村经济与科技，2020，31（18）：36-37.

［8］项 鹏，郝建国，张 武，等. 大豆胞囊线虫生防放线菌的田间防效评估及其鉴定［J］. 中国油料作物学报，2017，39（2）：234-238.

［9］陈立杰，陈井生，段玉玺，等. 防治大豆孢囊线虫的生防放线菌初步筛选［J］. 植物保护，2008，34（3）：116-119.

［10］黄姗姗，段玉玺，陈立杰，等. 诱导大豆抗逆细菌的筛选及分子鉴定［J］. 大豆科学，2011，30（2）：205-210.

［11］刘大伟. 灰皮支黑豆对大豆胞囊线虫3号生理小种抗性机制研究［D］. 沈阳：沈阳农业大学，2011：40-41.

［12］沈文飚，徐朗莱，叶茂炳，等. 抗坏血酸过氧化物酶活性测定的探讨［J］. 植物生理学通讯，1996，32（3）：203-205.

［13］Lu Z Q，Liu D L，Liu S K. Two rice cytosolic ascorbate peroxidases differentially improve salt tolerance in transgenic Arabidopsis［J］. Plant Cell Reports，2007，26（10）：1909-1917.

［14］Chao W，Yang C P，Wang Y C. Cloning and expression analysis of an APX gene from Betula platyphylla［J］. Journal of Northeast Forestry University，2009，37：79-88.

［15］Park S Y，Ryu S H，Jang I C，et al. Molecular cloning of a cytosolic ascorbate peroxidase cDNA from cell cultures of sweetpotato and its expression in response to stress［J］. Molecular Genetics and Genomics，2004，271（3）：339-346.

［16］Shi W M，Muramoto Y，Ueda A，et al. Cloning of peroxisomal ascorbate peroxidase gene from barley and enhanced thermotolerance by overexpressing in Arabidopsis thaliana［J］. Gene，2001，273（1）：23-27.

［17］Kornyeyev D，Logan B A，Payton P，et al. Enhanced photochemical light utilization and decreased chilling-induced photoinhibition of photosystem Ⅱ in cotton overexpressing genes encoding chloroplast-

targeted antioxidant enzymes［J］. Physiologia Plantarum，2001，113（3）：323-331.

［18］Caldwell C R，Turano F J，McMahon M B. Identification of two cytosolic ascorbate peroxidase cDNAs from soybean leaves and characterization of their products by functional expression in E.coli［J］. Planta，1997，204（1）：120-126.

［19］Sarowar S，Kim E N，Kim Y J，et al. Overexpression of a pepper ascorbate peroxidase-like 1 gene in tobacco plants enhances tolerance to oxidative stress and pathogens［J］. Plant Science，2005，169（1）：55-63.

［20］Li Y J，Hai R L，Du X H，et al. Over-expression of a Populus peroxisomal ascorbate peroxidase （PpAPX） gene in tobacco plants enhances stress tolerance［J］. Plant Breeding，2009，128（4）：404-410.

［21］Yabuta Y，Motoki T，Yoshimura K，et al. Thylakoid membrane-bound ascorbate peroxidase is a limiting factor of antioxidative systems under photo-oxidative stress［J］. The Plant Journal，2002，32（6）：915-925.

［22］方 涛，董艳苹，李亚楠，等. 水稻叶绿体抗坏血酸过氧化物酶在干旱和高盐胁迫中的作用［J］. 植物生理学报，2015，51（12）：2207-2213.

［23］邵振启，孔佑宾，李喜焕，等. 抗坏血酸过氧化物酶基因OsAPX2转化大豆及耐旱功能分析［C］//2017年中国作物学会学术年会摘要集.保定，2017：156.

收稿日期：2023-03-30

基金项目：国家大豆产业技术体系建设专项（编号：CARS-04）；农业基础性长期性工作植保中心爱辉试验点项目（编号：NAES-PP-033）；黑龙江省第二批“揭榜挂帅”科技攻关项目（编号：2021ZXJ05B011）。

作者简介：项 鹏（1986—），男，黑龙江肇州人，硕士，助理研究员，主要从事植物线虫学研究。E-mail：xp_303@126.com。

通信作者：张 武，硕士，副研究员，主要从事大豆病虫害研究。E-mail：guoguo_zw@163.com。