血清hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297作为心源性脑卒中诊断标志物的研究

刘旭阳 孙玉芳 汤舒洁 项涛

【摘要】目的 研究血清hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297与心源性脑卒中的关联性，及其作为诊断标志物的可行性。方法 GEO数据库整合分析筛选出可能的心源性脑卒中特异性miRNA（hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297），通过孟德尔随机化与共定位分析验证两个miRNA对心源性脑卒中发病的危险作用，并对它们在miRNA-mRNA调控网络中的靶基因进行富集分析来寻找相关通路。纳入2022年3月—2023年1月于成都市第三人民医院急诊科诊断新发缺血性脑卒中的患者共103例，其中心源性脑卒中22例（病例组），非心源性脑卒中81例（对照组）。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测血清hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297的表达水平，多因素逻辑回归分析其与心源性脑卒中的相关性，采用ROC曲线评估预测价值。结果 孟德尔随机化分析提示遗传预测的循环血液中hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297表达增高分别使心源性脑卒中的发病风险增加46%和70%。共定位分析提示循环血液中hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297的表达与心源性脑卒中存在共享遗传变异的概率分别为95%和86%。病例组血清hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297表达水平显著高于对照组（P＜0.05），hsa-miR3173-5p（OR=6.30，95%CI 1.79～22.14，P=0.004）和hsa-miR-4297（OR=12.38，95%CI 1.97～77.72，P=0.007）与心源性脑卒中有显著关联。hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.705和0.624，将hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297联合心房颤动共同进行分析，其AUC为0.842。结论 hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297的表达水平与心源性脑卒中具有密切关联，有望作为心源性脑卒中的诊断标志物。

【关键词】心源性脑卒中；miRNA；诊断标志物

【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2024.05.019

Serum hsa-miR3173-5p and hsa-miR-4297 as Diagnostic Markers of Cardiogenic Stroke

【Abstract】Objective To explore the levels of serum hsa-miR3173-5p and hsa-miR-4297 and their feasibility as the diagnostic markers in cardiogenic stroke.Methods GEO database integration analysis screened out possible cardiogenic stroke-specific miRNAs （hsa-miR3173-5p and hsa-miR-4297），verified the risk role of the two miRNAs in the development of cardiogenic stroke by Mendelian randomization and colocalization analysis，and their target genes in the miRNA-mRNA regulatory network were enriched to search for related pathways.A total of 103 patients newly diagnosed with ischemic stroke in the emergency department from March 2022 to January 2023 were included，among which 22 cases were cardiogenic stroke （case group） and 81 were non-cardiogenic stroke （control group）.The expression levels of serum hsa-miR3173-5p and hsa-miR-4297 were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction，and their correlation with cardiogenic stroke was analyzed by multivariable logistic regression.The predictive value was evaluated using the receiver operating characteristic （ROC） curve.Results Mendelian randomization analysis suggested that genetically predicted increased expression of hsa-miR3173-5p and hsa-miR-4297 in circulating blood increased the risk of cardiogenic stroke by 46% and 70% respectively.Colocalization analysis suggested that the expression of hsa-miR3173-5p and hsa-miR-4297 in circulating blood has a 95% and 86% probability of shared genetic variation with cardiogenic stroke，respectively.The expression levels of serum hsa-miR3173-5p and hsa-miR-4297 in the case group were significantly higher than in the control group （P<0.05），and hsa-miR3173-5p（OR=6.30，95%CI 1.79～22.14，P=0.004） and hsa-miR-4297（OR=12.38，95%CI 1.97～77.72，P=0.007） were significantly associated with cardiogenic stroke.The area under the ROC curve （AUC） for hsa-miR3173-5p and hsa-miR-4297 were 0.705 and 0.624 respectively，and the AUC of the combined analysis of hsa-miR3173-5p and hsa-miR-4297 with atrial fibrillation is 0.842.Conclusion The expression levels of hsa-miR3173-5p and hsa-miR-4297 are closely related to cardiogenic stroke，and are promising as diagnostic markers for cardiogenic stroke.

【Keywords】Cardiogenic stroke;miRNA;Diagnostic marker

脑卒中是全世界重大公共卫生问题，是第二位常见的死亡原因和第三位致残的主要疾病［1］，给社会和家庭造成极大负担。缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）占所有脑卒中的80%以上［2］，目前国际广泛使用的TOAST病因学分型将IS分为5个亚型［3］：大动脉粥样硬化（large-artery atherosclerosis，LAA）型、心源性栓塞（cardioembolic，CE）型、小动脉闭塞（small-artery occlusion lacunar，SAO）型、其他明确病因（stroke of other determined etiology，SOE）型和不明原因（stroke of other undertermined etiology，SUE）型，准确分型对临床决策和预后评估至关重要。其中CE型病情最重、死亡率最高、预后最差，约占IS总数的20%［4］，早期诊断CE型脑卒中是IS救治的重点和难点之一。

miRNA在不同疾病中起调控作用，稳定性好，易检测，具有作为疾病诊断标志物的广泛前景［5］。本课题组前期基于生物信息学方法，筛选出可能与CE型脑卒中相关的特异性miRNA（hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297），现拟研究hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297在急性IS患者中的表达水平，以期提高CE型脑卒中患者早期诊断率，为后续治疗方案的选择提供参考。

1 资料与方法

1.1 生物信息学方法

本课题组前期已经通过生物信息学方法对已发表与脑卒中相关的miRNA和mRNA高通量数据进行整合分析，运用多种工具、算法分析预测靶向miRNA-mRNA关系，然后用Cytoscape软件构建由miRNA和mRNA组成的生物信息调控网络。进一步通过孟德尔随机化与共定位分析验证了两个miRNA对CE型脑卒中发病的危险作用，通过预测miRNA的靶标mRNA，并分析其功能通路来预测循环miRNA参与脑栓塞的分子机制。

1.2 研究对象

前瞻性纳入2022年3月—2023年1月于成都市第三人民医院急诊科就诊并入院治疗的急性IS患者共103例，所有研究对象均在急诊科完成血液标本采集、病史记录和生命体征测量，并根据美国国立卫生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）进行评分［6］，在住院期间完成血常规、血生化（包括心肌酶、脑钠肽）、动态心电图、心脏彩超、血管神经影像学/脑血管造影等检查。参考《心源性卒中诊断中国专家共识（2020）》［7］，由两名神经内科主任医师共同对入组患者进行诊断和TOAST病因学分型，根据结果分为病例组（CE型脑卒中）和对照组（非CE型脑卒中）。

纳入标准： （1）发病72 h以内，诊断标准参考《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》［8］；（2）首次发病患者；（3）既往诊断脑卒中，无明显神经功能缺失，再发IS的患者。排除标准：（1）出血性脑卒中，包括脑梗死后出血的患者；（2）有神经系统、免疫系统疾病，近期使用免疫抑制剂、激素等药物的患者；（3）接受放化疗治疗的恶性肿瘤患者；（4）关键指标缺失的病例。

本研究已通过成都市第三人民医院伦理委员会批准（伦理审批号2021-S-30），所有研究对象及家属均已签署同意书。

1.3 标本采集和miRNA检测

符合标准的患者，均在到达急诊科1 h内完成血液标本采集，采取梯度离心方法，放置于-80 ℃冰箱中冷冻保存，24 h内行总RNA提取、纯化。miRNA检测步骤如下：（1）血浆miRNA的提取；（2）血浆miRNA浓度及纯度的鉴定；（3）RNA Poly（A）加尾；（4）逆转录为cDNA；（5）实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术检测目标miRNA相对表达；（6）PCR数据的采集和处理；（7）血清miRNA表达量的数据处理方法为2-ΔΔCT法。

1.4 统计学方法

采用R 4.2.2软件和SPSS 21.0软件进行统计学分析。满足正态分布和方差齐性的计量资料以均数±标准差表示，组间比较选择独立样本t检验；非正态分布的计量资料采用中位数（四分位数间距）表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。本研究多组比较中，各组数据均通过正态性和方差齐性检验，采用单因素方差分析。将单因素分析有意义的指标纳入多因素逻辑回归分析。用ROC曲线评估hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297对CE型脑卒中的预测价值，并计算曲线下面积（area under the curve，AUC），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 孟德尔随机化分析和共定位分析

基于miRNA eQTL数据的孟德尔随机化分析提示，遗传预测循环血液中的hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297表达增高，可使CE型脑卒中的发病风险分别增加46%和70%（图1A和1C）。共定位分析提示循环血液中hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297的表达与CE型脑卒中存在共享遗传变异的概率分别为95%和86%（图1B和1D）。

2.2 两组患者的一般情况

病例组的性别、年龄、血压、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病、血常规、凝血、肝肾功能、血脂和对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。病例组中合并心房颤动（房颤）10例、合并冠心病10例，比例明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05） 。病例组NIHSS 评分高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.3 两组患者hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297的表达水平

hsa-miR3173-5p在病例组和对照组表达量分别为1.44±0.67和0.98±0.56，hsa-miR-4297在病例组和对照组表达量分别为0.94±0.46和0.72±0.39。hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297在病例组的表达水平均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.4 对照组中不同TOAST分型患者的hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297表达水平

将对照组中患者根据TOAST病因学分型进行分组，由于本研究中SOE型无入组患者，故对照组患者分为LAA组、SAO组、SUE组。将3组患者hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297 表达水平进行对比，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表3。

2.5 多因素逻辑回归分析

结合既往文献报告CE型脑卒中的危险因素［7］，以是否发生IS为因变量，将单因素分析中P＜0.05的变量进行逻辑回归分析，结果显示房颤、hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297 是CE型脑卒中发生的危险因素，见表4。

2.6 hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297作为CE型脑卒中诊断标志物可行性分析

采用ROC曲线的方法分别分析hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297作为CE型脑卒中分子标志物的可行性（图2）。结果显示，hsa-miR3173-5p的AUC为0.705（P＜0.05）；hsa-miR-4297的AUC为0.624（P＞0.05）；将hsa-miR3173-5p、hsa-miR-4297和房颤进行联合分析，AUC为0.842（P＜0.05），见表5。

2.7 脑卒中患者发病相关hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297及靶基因的生物学功能

利用miRDB和TargetScan Human等数据库预测了两个未被研究的miRNA（hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297）的靶基因（564和833个），见图3。对靶基因的富集分析提示，hsa-miR3173-5p的靶基因主要富集在“嗜同性细胞通过细胞膜黏附分子黏附、运动的行为、细胞通过细胞膜黏附分子进行细胞黏附、对细胞因子的反应”等细胞黏附和细胞因子相关通路（图4A）。而hsa-miR-4297的靶基因主要富集在“通过质膜黏附分子实现同亲细胞黏附、运动的行为、单核细胞迁徙、细胞对细胞因子刺激的反应”等细胞黏附、细胞迁移和细胞因子相关通路（图4B）。

3 讨论

由心脏和主动脉弓的栓子引起的脑栓塞称为CE型脑卒中，相较于其他类型，CE型脑卒中病因复杂、病情严重［8-10］，且发病率在急性IS患者中不断升高［11］。对其确诊分型主要依赖于病史及心电图、心脏超声、磁共振成像、脑血管造影等辅助检查寻找病因学证据［11］，但在实际工作中，部分检查需提前预约，且存在费用偏高的情况，完成度不尽人意，导致了患者早期TOAST分型准确度较差［11-12］。国内外研究者尝试寻找CE型脑卒中的预测指标，其中脑钠肽和N末端脑钠肽前体被证实有一定预测价值［13］，但其主要适用于心力衰竭患者的评估，对CE型脑卒中诊断特异性低。寻找合适的CE型脑卒中诊断标志物，有利于更高效、准确地筛选出CE型脑卒中患者，从而实现制定系统化、个体化的诊疗策略和选择最佳的二级预防措施［11］。

miRNA具备调控作用，有着稳定性好、容易检测的优点，是良好的疾病诊断标志物［14］。已有相关研究［15-16］证实，miRNA在大脑不同种类细胞中具有很高的表达水平，可作为生物标志物来区分脑卒中亚型。有研究［17-18］发现，在出血性脑卒中患者血浆中，miR-124-3p水平高于IS患者，而miR-16水平低于IS患者；Li等［19］发现115个miRNA在IS中差异表达；Modak等［20］发现，与健康对照组相比，在CE型脑卒中患者中观察到14个miRNA的显著差异表达。因此，本研究选择miRNA作为研究对象来预测CE型脑卒中。目前，微阵列和转录组测序技术（RNA-seq）已被广泛用于测量转录物、发现异常表达基因和识别新的生物标志物，并采用生物信息学方法处理这些数据。GEO数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）为全球研究者提供了微阵列和RNA-seq数据。本研究前期利用GEO数据库，通过生物信息学方法对已发表脑栓塞相关的miRNA和mRNA高通量数据进行整合分析并进一步全面检索中英文文献，发现7个miRNA有相关文献报道（hsa-let-7b-5p、hsa-miR-3148、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-32-3p、hsa-miR-133b、hsa-miR-940和hsa-miR-1237-3p），涉及肿瘤、神经系统疾病、呼吸系统疾病等多种疾病，但是hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297两个miRNA截至目前（2022.02.03）没有任何文献报道。本研究基于miRNA eQTL数据的孟德尔随机化分析提示遗传预测的循环血液中hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297表达增高分别使CE型脑卒中的发病风险增加46%和70%，共定位分析提示循环血液中hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297的表达与CE型脑卒中存在共享遗传变异的概率分别为95%和86%。因此推测它们可能与CE型脑卒中有关，而在miRNA-mRNA调控网络中的靶基因富集分析提示，其很有可能通过“嗜同性细胞通过细胞膜黏附分子黏附、运动的行为、细胞通过细胞膜黏附分子进行细胞黏附、对细胞因子的反应”等细胞黏附和细胞因子相关通路导致CE型脑卒中。

本研究中，CE型脑卒中患者外周血hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297表达水平明显高于对照组，将对照组进行亚组分析，发现hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297表达水平在LAA组、SAO组和SUE组中无明显差异，因此考虑hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297可能在CE型脑卒中特异性表达。纳入患者的各临床指标，单因素分析显示冠心病、房颤、NIHSS评分、hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297是CE型脑卒中的危险因素，进一步行多因素逻辑回归分析，房颤、hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297仍与CE型脑卒中显著相关。分别将hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297进行ROC曲线分析，结果显示hsa-miR3173-5p的AUC为0.705，具有一定的准确度，而hsa-miR-4297的AUC为0.624（P＞0.05），单独作为诊断标志物的效能较差。房颤是CE型脑卒中的独立危险因素［7］，并且由于血液中miRNA具有相关性，不同miRNA进行疾病预测具有联合作用［21］，因此将房颤、hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297进行联合分析，发现其具有较好的准确度（AUC为0.842），且差异有统计学意义。因此，本研究推测hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297的表达水平升高可能与CE型脑卒中发病风险增加有关，后续期待纳入更多的样本量来评估预测价值。

研究发现，在患胶质瘤的女性患者中，miR-4297与平均血小板体积呈正相关［22］，血小板与血管炎症反应、血栓形成、动脉硬化密切关联［23］。本研究中hsa-miR-4297表达水平与血小板数量呈正相关，考虑hsa-miR-4297可能在血小板的合成代谢过程中起了一定作用。进一步对hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297的靶基因进行蛋白质相互作用网络分析提示，hsa-miR3173-5p靶基因的hub基因主要是STAT3、HTT、AP2B1，而hsa-miR-4297靶基因的hub基因主要是PRKACB、MED1、AKT2、CAMK2A、PTEN等。本研究是国内外首个关于特异性血清miRNA作为CE型脑卒中诊断标志物的研究，相关miRNA及其具体调控方式还缺乏报告，其靶基因与CE型脑卒中的具体机制尚需更深入的探索。

综上所述，hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297与CE型脑卒中密切相关，联合分析时具有较好的预测性，有望成为CE型脑卒中的诊断标志物。对其具体靶基因调节机制、不同时间点的表达水平变化、早期干预是否有利于患者预后等问题，有待进一步研究。

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