lncRNASLC9A3-AS1在肝细胞癌中的临床意义及生物学功能分析

蒲俊霞 史俊豪 单杰 邓益斌

【摘要】目的探讨lncRNASLC9A3-AS1在肝细胞癌（HCC）中的表达意义和其参与HCC发生发展的潜在作用机制。

方法收集37例HCC组织及其配对癌旁组织，以及HCC细胞RNA，利用qRT-PCR检测lncRNASLC9A3-AS1在组织和细胞中的表达水平，并分析其与患者临床病理特征的关系。绘制lncRNASLC9A3-AS1的受试者工作特征（ROC）曲线，分析其对HCC的诊断效能。通过生物信息学方法筛选与lncRNASLC9A3-AS1结合的RNA结合蛋白，并绘制韦恩图，分析lncRNASLC9A3-AS1与结合蛋白表达的相关性，以及蛋白表达与HCC病理分期和患者生存预后的关系。

结果lncRNASLC9A3-AS1在HCC组织和细胞中表达下调，其表达水平与患者血清甲胎蛋白（AFP）水平明显相关（P<0.05）。lncRNASLC9A3-AS1的ROC曲线下面积（AUC）为0.849（95%CI：0.796～0.886）。韦恩图显示5个与lncRNASLC9A3-AS1潜在结合的蛋白：hnRNPA1、YTHDC1、RBM4、NONO和RBMx，其表达与lncRNASLC9A3-AS1表达呈明显正相关（P<0.05）。随着HCC分期的进展，不同分期的RNA结合蛋白表达量差异有统计学意义（P<0.05）；RBM4、NONO和RBMx低表达患者总体生存期明显长于高表达患者（P<0.05）。

结论lncRNASLC9A3-AS1在HCC中下调，有望作为HCC诊断的生物标志物，并且可能通过与RNA结合蛋白互作调控HCC进展。

【关键词】lncRNASLC9A3-AS1；肝细胞癌；诊断标志物；RNA结合蛋白

中图分类号：R735.7文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2024.05.001

AnalysisofclinicalvalueandbiologicalfunctionoflncRNASLC9A3-AS1inhepatocellularcarcinoma

PUJunxia1，2，SHIJunhao2，SHANJie2，DENGYibin1，3

（1.MedicalLaboratoryCenter，theAffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalities，Baise533000，

Guangxi，China;2.GraduateSchool，YoujiangMedicalUniversityforNationalities，Baise533000，Guangxi，China;

3.KeyLaboratoryofClinicalMolecularDiagnosisResearchforDiseaseswithHighIncidenceofWestern

GuangxiinGuangxiHigherEducationInstitutes，Baise533000，Guangxi，China）

【Abstract】ObjectiveToexploretheclinicalapplicationvalueoflongnon-codingRNAs（lncRNA）SLC9A3-AS1inhepatocellularcarcinoma（HCC）anditspotentialmechanisminvolvedintheoccurrenceanddevelopmentofHCC.

Methods37casesofHCCtissuesandtheirpairedparacanceroustissues，aswellasHCCcellRNA，werecollected.qRT-PCRwasusedtodetecttheexpressionlevelsoflncRNASLC9A3-AS1intissuesandcells，anditsrelationshipwiththeclinicopathologicalcharacteristicsofpatientswasanalyzed.Areceiveroperatingcharacteristic（ROC）curvewasgeneratedtoassessthediagnosticefficacyoflncRNASLC9A3-AS1forHCC.BioinformaticsmethodswereutilizedtoidentifyRNA-bindingproteinsthatinteractedwithlncRNASLC9A3-AS1，andVenndiagramwasdrewtoanalyzecorrelationbetweenlncRNASLC9A3-AS1andbindingproteinexpression，aswellasrelationshipbetweenproteinexpressionandHCCpathologicalstagingandpatientsurvivalprognosis.

ResultsTheexpressionoflncRNASLC9A3-AS1wasdown-regulatedinHCCtissuesandcells，anditsexpressionlevelwassignificantlyassociatedwithpatients'serumalpha-fetoprotein（AFP）levels（P<0.05）.TheROCareaunderthecurve（AUC）oflncRNASLC9A3-AS1was0.849（95%CI：0.796-0.886）.TheVenndiagramshowed5proteinspotentiallybindingtolncRNASLC9A3-AS1：hnRNPA1，YTHDC1，RBM4，NONO，andRBMx，andtheirexpressionsshowedasignificantpositivecorrelationwiththeexpressionoflncRNASLC9A3-AS1（P<0.05）.WiththeprogressionofHCCstaging，therewasastatisticallysignificantdifferenceinRNAbindingproteinexpressionlevelsamongdifferentstages（P<0.05）.TheoverallsurvivaltimeofpatientswithlowexpressionsofRBM4，NONO，andRBMxwassignificantlylongerthanthatofpatientswithhighexpressions（P<0.05）.

ConclusionLncRNASLC9A3-AS1isdown-regulatedinHCCandisexpectedtoserveasabiomarkerforthediagnosisofHCC，andmayregulateHCCprogressionbyinteractingwithRNA-bindingproteins.

【Keywords】lncRNASLC9A3-AS1;hepatocellularcarcinoma（HCC）;diagnosticmarker;RNA-bindingproteins

肝癌在全球范围内发病率居前列，是常见的致命癌症之一［1］。在我国，原发性肝癌是第五位常见恶性肿瘤和第二死因，主要由慢性病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性肝炎和肝硬化等疾病导致，造成了严重的健康问题，需要加强预防和治疗；肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是原发性肝癌的主要病理类型，其所占比例最高（85%～90%）［2-3］。由于疾病复杂、发展迅速、术后复发率高，严重影响了患者生存［4-5］。因此，研究HCC发生发展的分子机制对肝癌的诊疗具有重大意义。

长链非编码RNA（longnon-codingRNAs，lncRNAs）是一类保守性差且不能编码完整的蛋白质的RNA，可通过内源竞争RNA（competingendogenousRNAs，ceRNAs）机制、表观遗传修饰、自噬和调节免疫微环境等多种途径调控癌细胞增殖、转移、侵袭、凋亡、上皮间质转化等生物学行为，从而调控肿瘤的发生［6-8］。lncRNAs在细胞中的定位影响了lncRNAs的作用模式，而定位于细胞核中的lncRNAs多数与蛋白质相互作用［9］。lncRNASLC9A3-AS1位于5号染色体短臂上，已被证实可以通过竞争结合miR-486-5p促进鼻咽癌的发生发展，且SLC9A3-AS1表达与肺癌患者生存预后相关，其能海绵吸附miR-760增强非小细胞肺癌的发展［10-11］。但SLC9A3-AS1在HCC中的临床应用价值和作用机制尚未见研究报道。因此，本研究旨在分析SLC9A3-AS1在HCC中的表达及临床意义，并探讨其参与调控HCC的潜在分子机制，为HCC的诊断提供新思路。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1组织标本与临床资料收集

收集2020年12月—2023年5月于右江民族医学院附属医院行手术切除患者HCC组织及其癌旁组织（距肿瘤边缘<2cm）各37例。组织纳入标准：（1）手术前影像检查诊断为肝癌，手术切除后样本病理学鉴定诊断为HCC；（2）术前未接受任何放化疗等相关治疗。排除标准：（1）患者术前接受放化疗等相关治疗；（2）术后经病理学诊断为良性肿瘤或合并其他部位恶性肿瘤；（3）其他类型肿瘤转移到肝形成的转移性癌。同时收集患者的临床病理资料，包括年龄（29～75岁，中位年龄47岁）、性别（男33例、女4例）、血清HBsAg和甲胎蛋白（AFP）水平、肝硬化病史、肿瘤大小和数量及T分期情况。纳入研究的全部患者均签署了知情同意书。标本的获取和患者临床病理资料的收集均已经获得右江民族医学院附属医院医学伦理委员会批准（协议代码：YYFY-LL-2018-112）。

1.1.2实验试剂

胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）、DMEM基础培养基（美国Gibco）、青链霉素双抗溶液（北京索莱宝科技有限公司）、胰酶（北京索莱宝科技有限公司）、细胞核质分离试剂盒［英文特生物技术（北京）有限公司］、TRIzol试剂（美国赛默飞公司）、赛默飞逆转录试剂盒、SYBRGreenMastermix（上海翊圣生物科技有限公司）、引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］、内参GAPDH和U6［生工生物工程（上海）股份有限公司］。

1.2细胞培养

人肝癌细胞MHCC97H、HepG2和正常肝细胞LO2购买自广州赛库生物科技有限公司和武汉普诺赛生命科技有限公司。在37℃，含5%CO2的细胞培养箱中，用含10%胎牛血清和1%双抗的完全培养基培养细胞。

1.3实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

利用TRIzol试剂提取细胞和组织总RNA。采用逆转录试剂逆转录得到cDNA，并以cDNA为模板，用SYBRGreenMastermix配制反应体系，在LightCycler？倕96（瑞士Roche）仪器上对lncRNASLC9A3-AS1进行扩增。扩增条件：95℃，5min；95℃，10s；60℃，30s；40个循环。扩增结束后，按照公式2？傆bCT计算基因相对表达量。实验引物序列见表1。

1.4分析lncRNASLC9A3-AS1表达与HCC患者临床病理特征的关系

采用qRT-PCR检测HCC和癌旁组织中的SLC9A3-AS1表达，并以其在HCC组织中的相对表达量的中位数为分界值，将高于分界值的作为高表达组、低于分界值为低表达组，分析其表达与患者临床病理特征的关系。

1.5lncRNASLC9A3-AS1的ROC曲线分析

从TCGA数据库（https：//cancergenome.nih.gov/）中下载肝细胞癌（LIHC）数据集，通过R4.1.2软件提取374例肝细胞癌和50例正常肝组织样本中lncRNASLC9A3-AS1的表达量，利用pROC包绘制受试者工作特征（receiveroperatingcharacteristic，ROC）曲线。

1.6数据库预测与lncRNASLC9A3-AS1互作的RNA结合蛋白

根据购买自英文特生物技术（北京）有限公司的细胞核质分离试剂盒说明书分离细胞质和细胞核后，TRIzol试剂提取RNA，采用qRT-PCR检测SLC9A3-AS1在细胞中的分布。通过ENCORI数据库（starBase3.0；http：//starbase.sysu.edu.cn/）、RBPDB数据库（http：//rbpdb.ccbr.utoronto.ca/）和catPAPID数据库（http：//s.tartaglialab.com/page/catrapid_group）预测可能与SLC9A3-AS1结合的RNA结合蛋白（RNA-bindingproteins，RBPs）。在DrawVennDiagram在线绘图工具（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）上对预测结果取交集并制作韦恩图，筛选蛋白。

1.7肝细胞癌中SLC9A3-AS1与蛋白表达的相关性分析

选择ENCORI数据库中的“RNA-RNACoExpression”模块，分析TCGA-LIHC数据中SLC9A3-AS1表达与RBP表达的相关性。

1.8蛋白表达与肝癌临床病理分期和患者生存预后的关系分析

选择GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn）数据库中“ExpressionDIY”的“stage”和“Survival”模块，并选择LIHC数据集，分析基因表达水平与肿瘤分期和患者总体生存期的关系。

1.9统计学方法

采用R软件、SPSS26.0和GraphPadPrism9软件进行数据统计分析与作图。计量资料用均数±标准差（±s）表示。采用配对Wilcoxon符号秩检验对lncRNASLC9A3-AS1在肝细胞癌及其癌旁组织的表达进行统计分析。采用Fisher确切概率法统计分析SLC9A3-AS1水平与肝细胞癌患者临床病理特征之间的关系。检验水准：α=0.05，双侧检验。

2结果

2.1SLC9A3-AS1表达与HCC患者临床病理特征的关系

qRT-PCR检测结果显示，HCC组织中的SLC9A3-AS1表达水平低于癌旁组织（P<0.05）（图1A）；与LO2细胞相比，在MHCC97H和HepG2细胞中，SLC9A3-AS1表达下调（P<0.05或0.01）（图1B）。根据HCC组织中SLC9A3-AS1的相对表达量中位数，将SLC9A3-AS1分为高表达组和低表达组，分析其与患者临床病理特征的关系，结果显示，SLC9A3-AS1表达水平与HCC患者年龄、性别、肝硬化病史、肿瘤大小及数量和T分期等临床病理参数差异无统计学意义（P＞0.05），但与血清AFP水平明显相关（P<0.05）。见表2。

2.2lncRNASLC9A3-AS1对HCC的诊断效能

ROC曲线分析结果显示，HCC组织中SLC9A3-AS1ROC的曲线下面积（AUC）为0.849（95%CI：0.796～0.886）（图2）。

2.3筛选SLC9A3-AS1的潜在RNA结合蛋白

细胞核质分离后，qRT-PCR检测结果显示，SLC9A3-AS1分布于MHCC97H和HepG2细胞的细胞核（约90%）和细胞质（约10%）（图3A）。韦恩图结果显示，Starbase数据库、RBPDB数据库和catPAPID数据库预测结果中与SLC9A3-AS1潜在结合的RBPs分别有：81个、19个和2064个，取交集后获得5个RBP：hnRNPA1、YTHDC1、RBM4、NONO、RBMx（图3B）。

2.4SLC9A3-AS1与RNA结合蛋白的相关性分析

相关性分析结果显示，在374例LIHC组织中的hnRNPA1、YTHDC1、RBM4、NONO和RBMx表达水平与SLC9A3-AS1表达呈正相关（均P<0.05）（图4A-E）。

2.5RNA结合蛋白与肝细胞癌临床病理分期和患者生存预后的关系

GEPIA数据库中RNA结合蛋白表达与肿瘤病理分期关系的结果显示，随着肝细胞癌分期的进展，hnRNPA1［F=4.54，Pr（＞F）=0.004］、YTHDC1［F=3.57，Pr（＞F）=0.014］、RBM4［F=3.09，Pr（＞F）=0.027］、NONO［F=5，Pr（＞F）=0.002］和RBMx［F=5.62，Pr（＞F）=0.001］在不同分期之间的表达量差异均有统计学意义（P<0.05）（图5A-E）。生存分析结果显示，其中hnRNPA1、YTHDC1表达与患者总体生存期差异无统计学意义（P＞0.05）。RBM4、NONO、RBMx低表达患者总体生存期明显长于高表达患者（均P<0.05）（图6A-E）。

3讨论

肝癌的发病率在全球范围内仍保持持续增长［12］。由于肝癌发现和诊断较晚，且发病机制复杂，给治疗带来了相当大的困难。因此，寻找有效诊断和治疗措施，是目前肝癌研究亟待解决的关键问题。lncRNAs广泛参与了肝癌的发生发展过程。lncRNA通过与染色质相互作用、作为转录复合物的支架或影响转录因子的募集来调节转录过程［13］。通过调控自噬相关基因的表达和激活细胞保护性自噬等方式促进或抑制HCC细胞的自噬［14-15］。也可作为ceRNA分子或者与RBP互作调控HCC细胞增殖、侵袭、迁移和上皮-间质转化等生物学行为［16-18］。既往研究表明，lncRNASLC9A3-AS1可作为预后预测因子，海绵吸附miR-760增强非小细胞肺癌的发展［11］；也可通过竞争结合miR-486-5p来提高E2F6表达从而促进鼻咽癌的发生发展［10］，然而，lncRNASLC9A3-AS1在HCC中的临床价值以及参与其发生发展过程的分子机制仍待进一步研究。

本研究通过分析SLC9A3-AS1在37例HCC组织及配对癌旁组织中的表达及其与患者临床病理特征之间的关系，发现HCC组织中SLC9A3-AS1表达下调，且SLC9A3-AS1表达与患者血清AFP水平明显相关；ROC曲线分析结果表明SLC9A3-AS1对HCC具有良好的诊断价值。以上结果提示SLC9A3-AS1可能成为HCC诊断的有效靶标。另外，研究结果显示SLC9A3-AS1主要分布于HCC细胞的细胞核中，提示SLC9A3-AS1可能通过与蛋白质相互结合发挥生物学作用。RBPs在多种癌症中异常表达，参与基因表达的转录后调控以及细胞分化和代谢等重要细胞过程，RNA-RBP相互作用的失调通常是癌症等疾病发生的重要原因［19］。结合蛋白IGF2BP2和EIF4A3等能与非编码RNA相互结合形成复合体调节mRNA的稳定性，分别抑制肺腺癌和促进食管鳞癌的发生发展［20-21］。因此，本研究进一步探讨了SLC9A3-AS1参与HCC发生发展的潜在分子机制。基于生物信息学数据库筛选出与SLC9A3-AS1结合的RBP：hnRNPA1、YTHDC1、RBM4、NONO和RBMx，且相关性分析结果显示SLC9A3-AS1表达与以上蛋白表达均呈正相关。hnRNPA1、YTHDC1、NONO、RBM4和RBMx等结合蛋白，可通过调控肝癌细胞转移、增殖、迁移、侵袭、血管生成能力和细胞代谢等调节肝癌的发生发展［22-26］。最后，本研究通过分析hnRNPA1、YTHDC1、RBM4、NONO、RBMx表达与HCC病理分期和患者生存预后的关系，发现随着HCC分期的进展，hnRNPA1、YTHDC1、RBM4、NONO、RBMx的表达明显升高；RBM4、NONO、RBMx低表达患者总体生存期明显长于高表达患者。提示SLC9A3-AS1与RBP相互作用可能作为调控HCC进展的重要分子机制，为HCC的诊疗提供了新思路。但本研究尚未验证RBP在HCC组织中的表达水平，因此，后续研究将进一步验证RBP在收集的HCC组织中的表达以及探究它们在HCC发生发展中的具体作用机制。

综上所述，lncRNASLC9A3-AS1在HCC中低表达，有望成为HCC诊断的潜在生物标志物。

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