鸡滑液囊支原体PCR检测方法的建立

陈文平 李冬立 康翠翠 张妹 程春格 陈小娇 由鹏 王全武 蔡晓庆

摘 要：目前鸡滑液囊支原体（MS）在养鸡生产中时有发生，是一种顽固性、条件性疾病。在多种致病因素的作用易发，给养鸡生产造成了经济损失；为了快速诊断MS，特别是致病性鸡滑液囊支原体，本研究针对MS的VlhA基因设计特异性引物，通过优化反应条件，进行灵敏性试验、特异性试验和重复性试验，建立快速高效检测MS的PCR方法。试验结果表明：该检测技术具有较好的灵敏性、特异性强且CV＜3%，具有很好的符合性。

关键词：鸡滑液囊支原体；PCR；检测

中图分类号：S858.31文献标识码：B文章编号：1673-1085（2024）06-0027-05

鸡的滑液囊支原体感染（Mycoplasama synoviae infection），又称滑液囊支原体病，是一种急性或慢性传染性疾病，可引起鸡和火鸡的传染性滑液囊炎、慢性呼吸系统疾病及鸡蛋尖端综合征[1]。临床上主要表现为渗出性滑膜炎、腱鞘滑膜炎或粘液囊炎等，对鸡的生产性能造成了很大的影响。近几年来，MS在各个地区都陆续出现，各个品种的鸡均有发病，特别是商品蛋鸡、商品肉鸡及一些地方品种鸡等，且各个日龄均可感染；大多数成年鸡呈隐形感染。MS有垂直传播和水平传播2种传播方式，而呼吸道传播感染是该病的主要传播方式。临床上主要表现为呼吸啰音、鸡冠苍白、食欲减退、生长缓慢；严重的可出现胸骨囊肿、脚垫及脚关节肿胀、跛行等。临床剖检发现肝脏有尿酸盐沉积，脾脏、肾脏肿大等[2]。剖检病鸡，主要病理变化为附关节、跗关节和脚垫肿胀，肿胀部位囤积大量黄色胶冻样粘液。胸部发生囊肿，随着病程延长，胸骨关节被粘液或干酪样物质覆盖，爪垫内也存在脓性分泌物或干酪样渗出[3]。病鸡的睫鞘滑膜层出现广泛、散在和局灶性的炎性浸润[4]。部分鸡肝脾肿大、出现明显的纹路，肾脏肿大[5]。

总体来说，现有的全球家禽养殖场的支原体流行情况报告大部分都是血清学检测[6]，但血清学检测不能用于确定血清抗体的存在，可能缺乏特异性或灵敏性，因此，单纯的依靠血清转化的检测程序可能不够完善 。

本研究对MS疑似的病料进行病原的分离和鉴定是非常可靠的检测方法，但是该方法对菌的生长环境和条件极为苛刻，且耗时较长、难度较大；大型鸡场和兽医基层工作人员，大多数还是以平板凝集的试验来初步诊断。通过分离培养菌株，对MS分离菌株的VlhA基因设计特异性引物，建立快速准确的PCR检测方法，为临床检测MS提供一种快速的检测技术。

1  材料与方法

1.1 材料

1.1.1  菌株  鸡滑液囊支原体MS菌株（Y1株），火鸡支原体MM菌株、鸡毒支原体MG菌株均由峪口禽业疾控研发中心提供。

1.1.2  主要试剂  2×Rapid Taq Master Mix 购自美国Axgey公司。DL2 000marker、5×RT-缓冲液、pMD19-T载体、DNA核酸提取试剂盒购自日本TaKaRa公司。

1.1.3   主要的设备  核酸提取仪器、振荡器、PCR仪、研磨器、电泳仪。

1.2  方法

1.2.1  引物的设计  基于Genbank数据库中公布的鸡滑液囊支原体的VlhA基因序列（Genbank编号：HQ682228.2），本研究成功设计出一套针对鸡滑液囊支原体的通用引物。具体的引物序列详见表1。这些引物由上海生物生工工程有限公司负责合成。这一研究成果为进一步探索鸡滑液囊支原体的检测和分析提供了有力工具。通过对该基因序列的分析，我们可以更好地理解鸡滑液囊支原体的生物学特性，从而为鸡病的诊断和防控提供科学依据。

1.2.2  核酸的提取  参照日本TaKaRa公司的柱式提取的试剂盒操作说明进行核酸的提取。

1.2.3  质粒标准品的制备  本研究主要关注质粒标准品的制备过程。首先，将目的片段与pMD19-T载体连接，形成重组质粒，并将其转化到感受态细胞中进行培养。随后，提取含有pMD18-T的VlhA目的菌株中的质粒。为了确保质粒构建的正确性，对其进行测序鉴定，确保无误。最后，通过紫外分光光度计测定质粒的OD值，并在-20 ℃的条件下进行保存。这一过程为后续相关研究提供了可靠的质粒标准品。

1.2.4  MS普通PCR检测方法的建立  （1）PCR反应体系的优化：通过对PCR的反应体系进行配置，在优化过程中对引物浓度、退火温度等进行具体优化，确定反应条件（表2）。

反应程序包括初始变性，循环扩增，最终延伸和保存等步骤。具体为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 15s，72 ℃ 15 s，共42个循环；92 ℃ 5 min；4 ℃保存。为了检测PCR产物的正确性，使用1%琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测。根据电泳结果，选取疑似阳性PCR产物送至上海生工生物科技有限公司进行测序鉴定。这一过程为确保实验结果的准确性和可靠性提供了重要保障。

（2）灵敏性试验：分别以MS株为样本，再分别按照10倍稀释成0.42×109、0.42×108、0.42×107、0.42×106、0.42×105、0.42×104、0.42×103、0.42×102 copies/μL，共8个滴度。采用日本TaKaRa公司的柱式提取的试剂盒提取DNA为模板，按照优化好条件进行PCR，凝胶电泳读取试验结果。

（3）特异性试验：本研究以MS质粒标准品作为阳性对照样本，同时设置了MG和MM作为对照样本。采用TaKaRa公司的柱式提取试剂盒提取DNA为模板，利用PCR技术进行扩增；最后，通过凝胶电泳对PCR产物进行读取，分析结果。这一过程不仅验证了我们的实验方法，也为后续的研究提供了可靠的数据支持。

（4）临床试验：选取临床有呼吸道症状的鸡群（河北省某鸡场商品代鸡群），随机采取80份组织样品进行检测，按照优化条件进行PCR检测，每次实验均设立阳性对照、阴性对照。

2  结果

2.1  质粒标准品的制备

用构建好的MS质粒标准品为模板，利用F和R引物进行普通PCR扩增，核酸电泳检测结果和预期结果一致，得到大约183 bp的目的片段（图1），并进行基因序列测序，与NCBI数据库中的序列进行blast比对，结果表明质粒标准品符合VlhA的基因序列，可用于后续试验。

利用imple超微量分光光度计测量DNA的浓度，其浓度为92 ng/μL，根据公式换算成拷贝数0.17×1012 copies/μL。

2.2  灵敏性试验

通过优化后的检测条件，以质粒标准品为样本，稀释到0.42×1012 copies/μL后，再进行倍比稀释成0.42×10、0.42×107、0.42×106、0.42×105、0.42×104、0.42×103、0.42×102 copies/μL，共8个滴度，分别进行PCR扩增。结果显示：质粒标准品稀释到0.42×103μcopies/μL时仍然可以检测阳性条带（图2），稀释到0.42×102copies/μL以后仍出现条带，但是显示为弱阳性，表明该方法具有较高的灵敏性。

2.3  特异性试验

用MS质粒标准品为样本，分别以MG、MM为对照样本，以去离子水为阴性对照及空白对照组，为保证试验的准确性，做3组重复试验。试验结果表明：MS标准品为阳性，其他均为阴性（图3），表明该方法具有良好的特异性。

2.4  临床样品检测

采集临床出现精神萎靡、关节有积液等样品，应用优化的PCR反应体系和反应条件对疫苗、蛋清、蛋黄及鸡胚（尿囊腔液）样品中鸡滑液囊支原体的感染情况进行检测，其结果见表3。

3  讨论

鸡毒支原体和滑膜囊支原体长期以来对家禽养殖业的发展产生了深远的不利影响。因此，在早期感染的鸡身上检测滑膜囊支原体，并尽快采取有效的控制措施，从而达到净化鸡滑膜囊支原体的目的。鉴于其垂直和水平传播的特点，受感染的鸡混合感染其他细菌和病毒，因此引起疾病暴发，出现脚垫肿胀、关节积液等症状，但临床上很难通过症状诊断鸡支原体疾病并及时采取相应措施。因此，迫切需要建立一种特异、灵敏、可重复和快速的检测方法。

病原分离技术一直都是行业检测MS的金标准。MS的生长对环境要求苛刻，对营养条件有很高的要求，通常在其培养基中添加0.01%的NAD以及10%猪血清或者马血清。其生长的最适pH为7.5左右，当pH降至6.5甚至更低时开始大量死亡。因此，通过病原分离的方法对大量的临床样品进行检测比较困难。研究发现，MS的vlhA基因在不同的MS菌株之间具有99%～100%的高度同源性，针对MS vlhA基因相对保守的特定区域设计引物，在其特定序列（1～200 bp）内设计上游引物，并对目标基因的选择和引物进行特异性设计[7]。本研究结果表明，靶向MS vlhA基因的特异性引物可以特异性扩增混合样品中MS的靶片段，有效鉴定了混合样品中的MS。与OIE标准的MS普通PCR方法相比，MS-PCR方法可以有效避免操作不当导致的假阳性，有效避免了分子污染，使其更加方便、快速，并在一定程度上降低了检测成本，对检测方法的逐步简化，分子生物学方法更适合基层疫情检测和实验室广泛推广。

本研究建立的方法在前人研究的基础上，同样对引物的靶基因、引物序列、引物浓度和退火温度以及酶的用量和模板浓度进行了优化，选择了在MS属内高度保守且与其他病原体基因组具有差异区间的特异性基因vlhA作为检测目标，为滑液囊支原体单重及多重PCR检测方法的建立提供了另一有效的选择。本研究建立的PCR检测方法，以固定量的阳性质粒为模板，使用不同的酶和引物、探针浓度进行MS PCR反应，检测感染临床样品，对滑液囊支原体的阳性检出率高达83%以上，为滑液囊支原体感染流行病学调查研究以及进一步开展滑液囊支原体疫苗的研制奠定了基础。

参考文献：

[1]  艾文婷.某蛋种鸡场滑液囊支原体感染原因的分析[D].杨凌：西北农林科技大学，2016

[2]  王亮.山东省部分种鸡场鸡白痢和滑液囊支原体病的流行病学调查[D].泰安：山东农业大学，2015.

[3]  马银富.鸡滑液囊支原体病的流行病学、临床特征、实验室诊断及防控[J].现代畜牧科技，2020：100-101.

[4]  XU B， LIU R， DING M， et al.Interaction of Mycoplasma synoviae with chicken synovial sheath cells contributes tomacrophage recruitment and inflammation[J]. Poultry Science，2020，99： 5366-5377.

[5]  Kleven SH Rowland GN， Kumar MC. Poor serologic response to upper respiratoryinfection with Mycoplasma synoviae in turkeys. Avian Dis， 2001， 45： 719-723.

[6]  Feberwee A， de Vries TS， Landman WJ. Seroprevalence of Mycoplasma synoviae inDutch commercial poultry farms[J].Avian Pathol， 2008，37： 629-633.

[7]  钱琳娜，萨茹丽，许哲峰，等.鸡毒支原体鸡滑液囊支原体和副鸡禽杆菌三重 PCR检测方法的建立[J].中国兽医科学，2020，50（3）：314-320.

Establishing of the PCR Detection Method of a Smooth Liquid Pocket

CHEN Wenping1，LI Dongli，KANG Cuicui1， ZHANG Mei1，CHENG Chunge，

CHEN Xiaojiao1，YOU Peng，Wang Quanwu，cai xiaoqing 12*

（1.Beijing Huaduyukou Poultry Industry Co.，Ltd.，Beijing 101206，China;

2.Pinggu Comprehensive Test Station of National Laying Hens Industrial Technology System，Beijing 101206，China）

Abstract： At present， the proportion of chlamydiac （MS） in a smooth liquid sac pocket is a high proportion of chicken -raising production， which is a refractory and conditional disease. Under the effect of a variety of diseased factors， it has increased and easy to occur， causing huge economic losses to the production of chicken breeding; in order to quickly diagnose MS， especially the pathogenic bodies of the pathogenic fluid， Specific primers， by optimizing the reaction conditions， conducting sensitivity tests， specific tests， and repeated tests to establish a PCR method for fast and efficient testing MS. The test results show that the detection technology has good sensitivity， strong specificity， and CV <3%， which has good compliance.

Keywords： Smochye Pork Pystogen supports; PCR; detection