糖酵解在特发性肺纤维化中的作用及机制研究进展

杜香林 霍如婕 田新瑞

特发性肺纤维化 (idiopathic pulmonary fibrosis, IPF) 是一种慢性、进展性纤维化间质性肺炎,临床表现为呼吸困难和肺功能的进行性恶化[1]。目前病因不明,中位生存期为诊断后的3-5年,在美国,IPF的患病率报告为10-60例/100000例,并且呈现上升趋势[2,3]。该疾病的组织学类型是普通型间质性肺炎,表现为肺泡上皮细胞反复损伤和肺泡结构破坏,肺成纤维细胞活化为肌成纤维细胞和巨噬细胞释放促纤维化介质诱导细胞外基质大量沉积[4]。尼达尼布和吡非尼酮能够减缓疾病进展,改善预后,被批准用于IPF的抗纤维化治疗[5,6]。但是,两种抗纤维化药物不能逆转IPF[7],肺移植仍是目前唯一能够提高患者生存质量和延长生存期的治疗方式[8]。

IPF与多种生物学过程异常有关,包括氧化剂/抗氧剂失调、细胞凋亡、血管重塑、上皮间质转化以及代谢失调等[9,10]。尽管已经进行了广泛的研究,但目前对于IPF潜在的病理生理机制仍然知之甚少。近年来,许多研究表明有氧糖酵解在IPF的进展中起重要作用[11,12]。糖酵解参与成纤维细胞/肌成纤维细胞活化、细胞外基质沉积和内皮间质转化。糖酵解酶及其代谢产物的增加,促进了肌成纤维细胞的分化和细胞外基质的沉积,在IPF发生发展中起关键作用[13]。本文就糖酵解在IPF中的作用机制及抑制异常糖代谢的药物综述如下。

一、成纤维细胞的糖酵解异常

糖酵解途径中有己糖激酶2 (hexokinase 2, HK2) 、磷酸果糖激酶-1 (phosphofructokinase-1, PFK1) 和丙酮酸激酶M2 (pyruvate kinase isozyme type M2, PKM2) 催化的三个不可逆反应。糖酵解在无氧条件下产生丙酮酸后,发酵成乳酸或被氧化为乙酰辅酶A进入三羧酸循环。Warburg发现在有氧条件下也可发生糖酵解,葡萄糖摄取率高,增强的糖酵解有助于增加乳酸的生成,该过程常见于肿瘤细胞[14]。越来越多的研究表明,Warburg效应在非肿瘤疾病中起关键作用[15]。纤维化肺组织具有高度代谢活性,IPF患者肺组织的有氧糖酵解水平上调[11,16],可以满足肺成纤维细胞的高代谢需求。糖酵解相较氧化磷酸化循环速度更快,增加了中间体的产生,这些中间体作为增加细胞外基质的基础[13]。同时其副产物的产生对肌成纤维细胞的分化具有重要作用。

IPF患者的肺成纤维细胞中的糖酵解代谢相关酶水平显著上调,介导纤维化进程。HK2是负责在糖酵解的第一步中产生6-磷酸葡萄糖的酶,HK2在特发性肺纤维化患者的肺成纤维细胞中升高,促纤维化因子TGF-β通过Smad 2/3和c-Myc诱导HK2在小鼠和人肺成纤维细胞中的积累,增加了这些细胞中的糖酵解[17]。此外,Smad 2/3依赖性 TGF-β1信号也介导纤维化肺组织中6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二酸酶3 (6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2, 6-bisphosphatases 3, PFKFB3) 表达上调,增加糖酵解。PFKFB3是一种产生2,6双磷酸果糖 (F2,6P2) 的代谢酶,F2, 6P2是限速酶PFK-1的有效变构激活剂[18]。PFKFB3参与小鼠和人的肺肌成纤维细胞分化,抑制PFKFB3能够逆转IPF肌成纤维细胞的促纤维化表型。3PO是PFKFB3的抑制剂,3PO能显著减弱了TGF-β和博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型的胶原沉积,抑制小鼠肺中的糖酵解和肺纤维化[19]。另外有研究显示,在脂多糖诱导的肺纤维化模型中,肺成纤维细胞通过激活PI3K-Akt-mTOR/PFKFB3通路,上调PFKFB3的表达进而增强糖酵解,促进胶原合成[20]。研究发现PFKFB3不仅存在于纤维化肺组织中,也存在于正常小鼠的肺上皮细胞、基质细胞和巨噬细胞中[19],但这些细胞诱导PFKFB3在肺纤维化的发病机制尚有待进一步研究。

PKM2是催化糖酵解的最后一步,是糖酵解的关键酶之一。PKM2通过直接与Smad7相互作用和增强TGF-β1信号转导而促进纤维化进程。PKM2缺失可明显减轻博来霉素诱导的纤维化进程、肌成纤维细胞分化和TGF-β1信号转导的激活[21]。

乳酸作为一种重要的纤维原性细胞因子,是糖酵解的主要副产物[22]。IPF患者肺组织中乳酸和乳酸脱氢酶-5 (lactate dehydrogenase-5, LDH-5) 浓度升高,LDH-5过表达增加乳酸产生,同时降低pH值。乳酸通过pH依赖性的方式激活TGF-β,诱导肌成纤维细胞的分化。TGF-β诱导缺氧诱导因子-1α (hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α) 表达,HIF-1α过表达与LDH-5过表达可与低剂量TGF-β协同诱导肌成纤维细胞分化[23]。此外,糖酵解的增强导致三羧酸循环中间产物琥珀酸增加,琥珀酸的蓄积抑制了HIF-1α的羟化,导致了HIF-1α稳定,进而促进了肌成纤维细胞的分化。HIF-1α在肺肌成纤维细胞中上调,是肌成纤维细胞分化所必需的,抑制糖酵解可减少肌成纤维细胞中的HIF-1α[19]。

此外,与非IPF纤维化间质性肺病患者相比,IPF患者有较高的劳力性和静息性低氧血症的累积发生率[24]。Alexandra等研究发现,低氧条件下,正常肺成纤维细胞加强了对培养基中葡萄糖的吸收,葡萄糖转运体1(glucose transporter 1, GLUT1)和己糖激酶Ⅱ表达上调。在低氧条件下,MRC5肺成纤维细胞表现出丙酮酸激酶水平下降并显著诱导丙酮酸的功能形式。磷酸化的丙酮酸脱氢酶在低氧状态下保持稳定。成纤维细胞在缺氧环境下没有向无氧糖酵解途径转变,而是通过有氧途径获得能量[25]。但该项研究反映的是成纤维细胞对急性缺氧的代谢反应。因此,在低氧条件下,肺内成纤维细胞的代谢调控机制仍需进一步研究。

二、巨噬细胞的糖酵解异常

糖酵解的增强不仅发生在肺成纤维细胞中,在巨噬细胞中糖酵解也增强。巨噬细胞极化在特发性肺纤维化的发生发展中具有重要作用。在组织损伤早期阶段,M1型巨噬细胞通过分泌促炎性细胞因子促进炎症反应。在肺纤维化发展的中后期阶段,巨噬细胞向M2极化,M2型巨噬细胞通过分泌趋化因子、TGF-β、血小板源性生长因子和基质金属蛋白酶等,介导成纤维细胞的增殖和活化,促进肺纤维化的发展[26-28]。抑制M2型巨噬细胞的极化,减弱M2型巨噬细胞在肺泡中的浸润,可以抑制博来霉素诱导的大鼠肺纤维化[29]。

通过调节糖代谢可以改变M1/M2型巨噬细胞极化的平衡。纤维化肺泡巨噬细胞糖酵解增强,糖酵解相关介质(如HK2、磷酸果糖激酶、PFKFB3、肝脏磷酸果糖激酶[phosphofructokinase liver type, PFKL)、乳酸脱氢酶B (lactate dehydrogenase B, LDHB)和 GLUT1等]的表达显著增加[30]。

有氧糖酵解产生的高乳酸是Warburg效应的本质特征,乳酸刺激能够显著增加巨噬细胞中的促纤维化因子的表达,如血小板源性生长因子、血管内皮生长因子和血小板反应素1等。在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中发现,相较正常小鼠,IPF小鼠肺中存在增强的组蛋白乳酸化,乳酸通过在其启动子处诱导组蛋白乳酸化来诱导肺泡巨噬细胞中促纤维化介质的表达。在M1巨噬细胞极化后期,组蛋白乳酸化增强,可诱导M2样基因的表达。肌成纤维细胞通过乙酰转移酶p300介导组蛋白乳酸化,促进巨噬细胞极化[31]。

脂多糖相关的巨噬细胞 M1 极化主要由糖酵解驱动,而IL-4驱动的巨噬细胞 M2 替代极化则依赖于氧化磷酸化和脂肪酸氧化[32]。丙酮酸激酶是糖酵解的关键酶,其中PKM2是脂多糖激活巨噬细胞糖酵解的关键因素,PKM2的激活减弱了脂多糖诱导的促炎M1巨噬细胞表型,同时促进了M2巨噬细胞的典型特征[33]。HK2抑制剂2-DG抑制糖酵解能够减弱M2标志物的表达[34]。在博来霉素和TGF-β诱导的肺纤维化小鼠模型中,Xie等[30]发现使用PFKFB3抑制剂3PO处理细胞,能够减弱M2标志物的表达,HK2抑制剂2-DG甚至能逆转原纤维化M2样基因。以上均表明糖酵解对M2巨噬细胞的激活具有重要作用。Wang等[35]研究发现2-DG对糖酵解和氧化磷酸化联合抑制时,通过阻断JAK-STAT6通路的激活及其所依赖的基因的表达,进而抑制M2型巨噬细胞的分化。在氧化磷酸化保持活性的情况下,糖酵解对巨噬细胞向M2型的极化不是必须的。但在氧化磷酸化受损的情况下,抑制糖酵解和氧化磷酸化会减少细胞内ATP的含量,并抑制M2型巨噬细胞的分化。糖酵解在肺纤维化巨噬细胞极化的作用机制需进一步研究确定。

此外,研究发现,慢性缺氧状态下,巨噬细胞葡萄糖摄取、乳酸分泌和ATP合成减少。慢性缺氧条件下的巨噬细胞很少通过糖酵解利用葡萄糖获得能量,而是优先将葡萄糖高效转运至非典型戊糖磷酸途径,提供核苷酸从头合成所必须的五碳核苷酸,产生NADPH用于维持氧化还原稳态适应慢性缺氧[36]。关于低氧条件下,IPF患者巨噬细胞的代谢机制尚有待进一步探讨。

三、药物干预糖酵解过程治疗肺纤维化

安罗替尼是一种酪氨酸酶抑制剂,目前已被批准用于晚期非小细胞肺癌的治疗[37]。有研究报道,安罗替尼可通过抑制TGF-β信号转导途径减轻博莱霉素诱导的肺纤维化,抑制上皮间质转化并促进肺泡上皮细胞的凋亡[38]。研究发现安罗替尼可以抑制博来霉素诱导纤维化小鼠肺中PFKFB3的表达。安罗替尼通过下调多聚胞嘧啶结合蛋白3 (poly C binding protein 3, PCBP3) 、减少PFKFB3翻译和抑制肌成纤维细胞中的糖酵解来发挥抗纤维化作用。安罗替尼可以显著逆转博来霉素诱导的肺功能下降,并且安罗替尼降低了博来霉素诱导的小鼠肺中的胶原沉积。进一步研究发现,安罗替尼治疗降低了纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原和α-SMA的表达。以上均表明安洛替尼可减轻博来霉素诱导的肺纤维化。此外,对于已建立的纤维化病灶,安罗替尼可以在体内加速纤维化的消退[39]。

Alamandine (ALA) 是一种RAS家族的新成员,既往研究表明可以通过减轻氧化应激损伤和通过MrgD受体诱导自噬来抑制博来霉素诱导的肺纤维化[40]。Wang等[41]发现ALA可以通过抑制糖酵解进而抑制成纤维细胞的激活。ALA在蛋白和转录水平上调节PFKFB3和HK2的表达,并诱导它们通过自噬-溶酶体途径降解。ALA不仅降低了纤维化肺中PFKFB3和HK2的水平,而且还降低了Ⅰ型胶原、PFKFB3和HK2的共定位。ALA/MrgD轴通过激活Parkin/LC3介导的线粒体自噬来抵消糖酵解,从而抑制TGF-β1诱导的肺成纤维细胞激活。在博来霉素诱导的小鼠纤维化模型中。使用ALA (50 μg/kg/day)治疗14天后,显著减少了肺组织内胶原的沉积,并且ALA可以改善肺纤维化的呼吸力学,ALA治疗后的小鼠动态顺应性 [(0.47 ± 0.04) cmH2O/mL]与健康小鼠[(0.48 ± 0.02) cmH2O/mL]相近[42]。

IR-780是一种具有亲脂阳离子性质的七甲川花菁染料,有良好的荧光特性和线粒体靶向能力[43]。IR-780能够选择性地积累到受损的肺组织和成纤维细胞线粒体中,可以轻度抑制成纤维细胞中的琥珀酸脱氢酶来抑制糖酵解,下调TGF-β1诱导的成纤维细胞的增殖能力,进而抑制肺纤维化和呼吸功能障碍。同时IR-780可以表征HIF-1或糖酵解过度活跃的细胞群,并且糖酵解会增强IR-780在细胞中的滞留,并可能导致琥珀酸脱氢酶A受到重度抑制和肌成纤维细胞中活性氧过多,选择性的诱导肌成纤维细胞的凋亡[44]。

DACT2是DACT基因家族成员之一,在各种器官的组织发育、修复和再生中起着重要作用[45]。体外实验证实过表达DACT2可显著抑制TGF-β诱导的肺肌成纤维细胞中α-SMA和I型胶原的上调。DACT2通过下调乳酸脱氢酶A的表达,抑制有氧糖酵解和肺肌成纤维细胞的分化,从而可以作为肺纤维化的治疗靶点[46]。

高迁移率族蛋白1 (high mobility group box1, HMGB1) 主要表达于肺泡巨噬细胞,在肺纤维化中HMGB1升高,体外研究显示HMGB1通过浓度依赖性的方式增强有氧糖酵解。HMGB1通过上调HIF-1α的表达,诱导有氧糖酵解增加,上调乳酸水平,促进成纤维细胞增殖和细胞外基质的产生[47]。有许多研究显示HMGB1抑制剂可明显减轻肺纤维化[48,49]。但目前尚无直接证据证明HMGB1抑制剂通过抑制糖酵解途径减轻肺纤维化,未来需进一步的研究来探索HMGB1抑制剂对糖酵解途径的影响及其减轻肺纤维化的机制。

四、总结与展望

有氧糖酵解在IPF进展和调节巨噬细胞表型分化中有重要作用,阐明糖酵解在肺纤维化中的作用及机制对于 IPF的诊断和治疗至关重要。本文阐述了HK2、PKM2、PFKFB3、乳酸和琥珀酸等酶或代谢产物的异常表达在特发性肺纤维化中的调控机制以及在巨噬细胞分化中作用。此外,一些抑制糖酵解药物已经在IPF相关实验中证实具有良好的抗纤维化作用,未来的研究需要针对糖酵解相关酶在IPF发病机制中的具体作用及靶向药物调控机制开展大量的体内外实验研究和临床试验,为IPF的治疗提供新的策略。