阿尔茨海默病外周血早期生物标志物及其分析方法研究进展*

祁 艳 综述,张臻昊,刘 玉,刘欣梦,陈娜娜,劳可静 审校

(西安医学院/基础与转化医学研究所,陕西 西安 710000)

阿尔茨海默病(AD)是一种起病隐匿、病理复杂的神经退行性疾病,临床特征包括不可逆脑损伤、认知障碍、日常生活自理能力下降,最终可发展为痴呆和死亡。据统计,AD已发展为最常见的痴呆和世界范围内老年人残疾增加的主要原因[1]。目前,AD临床诊断主要依靠影像学技术结合认知测试[2-3],通常确诊时已发展到中晚期。虽然AD尚无有效的治疗方法,但早期诊断和干预仍有利于减少神经损伤,延缓病情进展,从而提高患者的生活质量。

AD患者的病理学特征主要为β淀粉样蛋白(Aβ)在大脑中细胞外沉积形成老年斑,Tau蛋白的过度磷酸化造成脑神经细胞内的神经元纤维缠结[4-5]。在AD极早期,脑脊液(CSF)中某些蛋白标志物Aβ40、Aβ42、总Tau蛋白(T-tau)、过度磷酸化Tau蛋白(P-tau)等水平会发生改变[6]。然而,临床上为了实现CSF中标志物的检测,常需要通过腰椎穿刺获取CSF。但该方式为有创操作,对患者伤害较大,且价格昂贵,患者可接受度有限,不利于AD的早期诊断。MONTAGNE等[7]研究发现,AD患者血脑屏障存在损伤,导致CSF中某些蛋白标志物能够在疾病早期穿越血脑屏障,进入外周血循环,从而使得血液蛋白标志物水平在发病极早期就发生很明显变化。因此,外周血中AD蛋白标志物的无创检测技术因样本采集方便、创伤小,成为最具潜力的早期筛查和随诊手段,为AD早期诊断带来了新希望[8]。然而AD蛋白标志物在外周血中水平极低,传统免疫分析方法无法实现其水平的精准定量分析。近年来发展的一些免疫分析新技术,其灵敏度大大提高,被广泛应用于超微量蛋白标志物的分析[9-11]。本文对AD早期外周血生物标志物及其检测技术的研究进展进行了综述。

1 外周血中AD相关生物标志物

1.1Aβ Aβ由淀粉样前体蛋白经过β-分泌酶和γ-分泌酶连续裂解形成,最常见的是包含40个氨基酸的Aβ40与42个氨基酸的Aβ42[12]。在健康人脑组织中,Aβ的生成与清除处于动态平衡状态;在AD患者脑组织中,Aβ表达水平过量,清除作用减弱,导致其在细胞膜外逐渐沉积形成老年斑,对神经元产生毒性作用,使得神经元变性,最终导致AD的发生[4,12]。

最初的研究结果显示,AD组和对照组血液Aβ42水平无显著差异,提示血液Aβ42水平主要反映外周的情况,而非脑中的Aβ水平。在最近几项研究中,研究者将免疫沉淀反应质谱分析[13-14]及Elecsys免疫分析[15]等高灵敏度分析技术用于血液中Aβ的检测,由于这些检测平台具有更高的精度,并且可以在同一时间内测定同一样品中Aβ42和Aβ40水平,使得血液Aβ42/Aβ40比值在临床上展示出广阔的应用前景。如使用免疫沉底质谱测定血液中Aβ水平,可以准确预测基于正电子发射体层摄影(PET)成像的轻度认知障碍(MCI)和AD患者脑淀粉样蛋白状态[14]。淀粉样PET阴性但血液Aβ42/Aβ40比值异常的患者,在未来有很大风险会发展为PET阳性,说明血液Aβ42/Aβ40比值可用于预测和筛选淀粉样PET阳性个体及AD的早期初步筛查[13]。此外,基于Elecsys免疫分析测定血液中Aβ水平的研究同样表明,在AD发展的各阶段,血液Aβ42/Aβ40水平在预测Aβ状态时表现出较高的准确性[15]。以上研究结果均表明,血液Aβ在预测患者脑淀粉样蛋白状态及AD早期诊断方面具有广阔的应用前景。

1.2Tau蛋白及P-tau Tau蛋白是一种微管相关蛋白,通过与微管蛋白相互作用来维系神经元骨架系统的稳定[5]。AD发病机制的另一主流假说是,Tau蛋白的过度磷酸化造成的脑神经细胞内神经元纤维缠结(NFTs)。研究表明,AD患者脑神经细胞内NFTs的大量形成会导致神经元退化,从而释放Tau蛋白,使得CSF中Tau水平增加,其水平与MCI向AD的发展密切相关[16]。

相比CSF中Tau蛋白水平,穿越血脑屏障进入血液中的Tau水平非常低,由于检测手段受限及大量队列研究的缺乏,在早期研究中,有关血液Tau蛋白水平作为AD诊断标志物的报道较少见。近年来,由于检测技术的快速发展,研究者将单分子阵列(Simoa)和基于电化学发光技术的MSD检测系统用于AD患者血液中P-tau181、P-tau231和P-tau217的分析[17-21],使得血液P-tau蛋白水平作为AD早期诊断标志物的研究成为热点方向。一项研究表明,患者在临床上被诊断为AD前,血液P-tau181水平就开始升高,在MCI和痴呆期进一步升高,且血液P-tau181水平与CSF P-tau181水平及Tau PET呈正相关[17]。有研究表明,至少在患者死亡前8年,血液P-tau181就能准确预测AD的病理特征[19]。研究表明,AD患者血液P-tau181水平较对照组升高3.5倍左右,且可以有效地将AD与其他神经退行性疾病(如额颞痴呆病区)分开[18]。一项针对3个选定的队列共1 402例患者的研究发现,与其他血液标志物和核磁共振成像相比,P-tau217水平可以更好地将AD和其他神经退行性疾病区分开,其准确性与PET成像结果无显著差异[20]。在该项研究中,队列3为PSENI突变携带者,研究发现在不溶性Tau聚集物未被Tau-PET检测到即AD极早期时,血液P-tau217水平已经在AD患者中增加了大约7倍,甚至在认知障碍出现前20年,P-tau217水平就开始上升。最近的一项研究表明,血液P-tau231和P-tau217水平与AD患者脑中早期Aβ沉积最为相关,可以作为临床前AD患者Aβ病理学状态的生物标志物,其能够在患者大脑出现明显Aβ斑块前,更好地捕捉大脑Aβ的变化[21]。以上研究结果表明,Tau蛋白尤其是特定位点P-tau蛋白是具有广阔发展前景的AD早期诊断标志物。

1.3神经丝轻链蛋白(NFL) NFL是一种中间丝蛋白,主要表达于粗有髓轴突中,具有维持神经元结构稳定和调节轴突直径的作用。当轴突损伤时,NFL将释放到细胞空间外,导致CSF中NFL水平增加[22]。

在AD患者大脑中,神经元变性的发生会加速NFL向CSF和血液释放[22]。研究发现,CSF中NFL水平和血液中NFL水平相关,MCI和具有Aβ病理特征的AD患者血液NFL水平均高于健康对照组,且CSF和血液中NFL水平升高与认知能力下降、脑萎缩及脑代谢减退有关[23]。最近一项同时针对认知未受损(CU)、MCI和AD患者的研究发现,MCI和AD患者CSF和血液NFL水平均升高[24]。但在具有Aβ病理特征的CU患者中,只有CSF中NFL水平增加,血液中NFL水平没有变化,且在AD转基因小鼠模型中,随着Aβ病理特征的发展,CSF中NFL水平增加要先于血清。因此,对CU个体来说,与血液NFL相比,CSF中NFL可能更适合作为生物标志物进行早期诊断。此外,一项足够数量的队列研究结果表明,虽然AD患者血液和CSF中NFL水平增加,但其增加的特异性并不高,NFL水平在很多其他神经退行性疾病的血液和CSF中同样会升高,尤其是额颞叶痴呆、肌萎缩性侧索硬化症和非典型帕金森病[25]。

总之,CSF和血液中NFL水平升高与AD的发展密切相关,NFL虽然不是AD特异性的生物标志物,但仍然可能在AD早期筛查、预测病情发展及药物试验预后监测中起到不可替代的作用。

1.4外泌体 外泌体是一种长径在100 nm左右的细胞外囊泡,其中携带大量特异性蛋白、脂质、RNA、microRNAs、DNA等其他生物活性物质。在大脑中,外泌体可以来自包括神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞在内的所有细胞,在细胞通信及细胞功能调节中发挥关键作用,外泌体可以通过CSF广泛传播至整个大脑,且可以通过血脑屏障释放到外周血中[26]。

研究表明,外周血中神经元和星形胶质细胞来源的外泌体可以作为生物标志物反映AD患者的病理特征,并可用于AD早期诊断[27]。此外,神经源性外泌体中的多种特异性蛋白同样可以作为生物标志物反映AD的发展过程。SARDAR SINHA等[28]发现,AD患者大脑分泌的外泌体中Aβ寡聚体水平明显增加,且通过阻断脑源性外泌体的形成、分泌或摄取,减少Aβ寡聚体的扩散并降低其毒性。有研究团队发现,AD患者血液中神经源性外泌体内p-S396-tau、p-T181-tau及Aβ42水平均明显升高,其水平不仅可以在患者出现症状10年前预测AD的发生,还可以准确预测患者从MCI发展为AD的过程[29-30]。最近,一项针对外周血中神经源外泌体Aβ42、T-tau、P-tau181的研究发现,外周血神经源性外泌体中Aβ42、T-tau和P-tau181水平均可以反映AD患者大脑的病理变化,AD患者Aβ42、T-tau和P-tau181水平均明显高于MCI患者和对照组患者,且外泌体中3种蛋白水平与其在CSF中的水平高度相关,二者表现出相同的诊断能力[30-31]。该团队的另一项研究发现,通过联合检测血液外泌体中突触生长相关蛋白43、神经粒素、突触小体相关蛋白25和synaptotagmin 1水平[32],可以在患者产生认知障碍5～7年前预测AD的发生。

1.5其他生物标志物 除上述几大类主要生物标志物外,其他标志物如胶质细胞炎症反应标志物[33-38],氧化应激(OS)生物标志物[39-42],血液中microRNA[43-47]等同样有望作为新型生物标志物进行AD早期诊断。

神经炎症在AD早期发病机制中起重要作用[48-49]。研究表明,小胶质细胞表达的Ⅱ型髓系细胞触发受体(TREM2),与AD患者小胶质细胞激活和先天性免疫反应有关,可以作为AD早期谱系神经炎症的潜在标志物[34]。在AD早期,CSF中可溶性水解产物TREM2(sTREM2)水平升高。另一项研究表明,CSF中sTREM2水平与神经元变性和Tau病理学标志物相关,在T-tau阳性个体及具有AD病理学特征的T-tau阴性个体CSF中,sTREM2水平随时间增加[35]。此外,单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)同样与AD的发生密切相关。研究表明,血液MCP-1水平在AD早期与神经解剖学具有相关性,较高的MCP-1水平与较差的情景记忆力有关[36]。CSF中MCP-1水平升高可能会加剧AD早期的病理进程[37],MCP-1水平高的AD患者认知能力下降更快。在MCI队列中,联合检测CSF中MCP-1、Tau、P-tau、Aβ可以用来预测MCI发展为AD的可能性。除此之外,其他多项研究表明,CSF中白细胞介素(IL)-1α、IL-6、肿瘤坏死因子α、C-反应蛋白[33,38]等炎性细胞因子均有可能作为潜在生物标志物预测AD的发生。

过度OS产生的自由基,尤其是活性氧(ROS)的过度积累会损坏细胞核、线粒体、蛋白质和核酸等,从而损伤细胞[50]。在AD早期,Aβ沉积及Tau蛋白过度磷酸化造成的神经原纤维缠结会导致过度OS反应,激活AD相关信号通路[51],损伤中枢神经,加速AD的进程[52]。常见的OS标志物有同型半胱氨酸(Hcy)[39]、NADPH氧化酶[42]、8-羟基脱氧鸟苷[40-41]等。Hcy水平的升高会导致线粒体内ROS增加。有研究发现,在平均随访9.5年的7 274例受试者中,最终发展为AD与未发展为AD的个体相比,Hcy水平显著升高,较高的Hcy水平会增加老年人患AD的风险[39]。NADPH氧化酶是ROS的主要来源。有研究表明,NADPH氧化酶与个体认知状态之间存在很强的相关性,酶活性增加会导致认知下降,与健康人相比,MCI队列中NADPH氧化酶的活性增加,并在AD队列中保持升高[42]。

microRNA是一类内源性、非蛋白编码的微小RNA,其通过与靶标信使RNA结合,导致信使RNA降解或抑制信使RNA的翻译,从而调控基因的表达[53]。大量研究表明,miRNA的异常表达与AD的发生密切相关。如AD患者血清miR-29c-3p、miR-19b-3p[43]、miR-501-3p[44]、miR-223[45]水平下调,miR-455-3p[46]、miR-519[45]水平上调。此外,有研究表明,血浆miR-411[47]水平随着AD的发展明显升高,其可以有效区分MCI与轻度、中度和重度AD患者。

2 AD蛋白标志物的高灵敏度分析技术

在AD早期,只有少量蛋白标志物能够从CSF穿越血脑屏障进入外周循环,其在血液中丰度极低(fM级),传统免疫分析方法无法实现精准定量分析[54-55]。因此,如何在AD发病早期,实现血液中超微量蛋白标志物的精准定量分析,是目前利用血液蛋白标志物进行AD无创早期诊断面临的关键挑战。近年来发展的一些蛋白标志物分析新技术,其灵敏度大大提高,被广泛应用于神经疾病研究领域。

2.1单分子免疫技术 Quanterix公司基于单分子免疫阵列技术的Single-Molecule Arrays(Simoa)系统是最具有代表性的超灵敏蛋白检测方法[56],其主要原理是以每个微珠为独立的反应单元,依据泊松分布,在每个微珠表面负载一个或零个免疫复合物,将微珠分散装载到飞升级别的微孔阵列中,每个微孔只能容纳一个微珠,含有酶标记免疫复合物的微孔会发生单分子引发的酶促反应,产生局部高浓度的荧光产物,统计具有荧光信号的阳性微孔个数,即可实现数字式高灵敏度蛋白分子的定量分析[9]。

与基于检测整个反应体系输出的模拟信号的传统酶联免疫吸附试验(ELISA)检测模式相比,数字式ELISA检测模式克服了传统模式在靶标蛋白水平很低时,检测信号被大量扩散和稀释,检测信号无法被有效辨识、方法灵敏度受到显著限制的缺点[57]。即使待测样本中靶标蛋白水平极低,只要蛋白分子被微孔捕获并引发单分子酶促反应,阳性荧光微孔就可被识别统计。Simoa技术可以实现低水平蛋白标志物的灵敏准确分析,其灵敏度比传统ELISA提升了1 000倍以上,且结果更加准确。因此该系统常被用于超微量蛋白标志物的准确灵敏检测,尤其是神经系统疾病血液标志物的分析[58]。

此外,基于单分子检测技术(SMC)的Erenna单分子免疫检测平台在检测低丰度蛋白标志物时也体现出广阔的应用前景[59-60]。SMC技术基于传统的三明治夹心免疫分析方法,在磁珠表面形成免疫复合物,经过洗脱步骤,将荧光标记的检测抗体洗脱下来。激光的聚焦效应会形成一个非常狭小的检测空间“爱里斑”。这个空间集中了多达84%的激光能量,当洗脱下来的荧光标记的检测抗体通过高能量“爱里斑”时,超过阈值的荧光信号被共聚焦成像系统统计为阳性信号,通过计数阳性信号,可以实现靶标蛋白的数字式高灵敏度分析。该技术融合了独特的洗脱步骤和可靠的数字计数,与传统免疫检测技术相比,信噪比有了显著的改善,大大提高了检测灵敏度,被广泛用于超微量蛋白标志物的灵敏检测。

2.2Meso Scale Discovery(MSD) 基于电化学发光的MSD技术也被广泛用于超高灵敏度蛋白标志物分析[61]。该技术的主要原理如下:在石墨电极微孔板里包被捕获抗体,加入靶标蛋白和钌复合物标记的检测抗体,形成免疫复合物,钌复合物能够在氧化电极上产生电化学信号,从而实现靶标蛋白的定量分析[10]。该技术的样本用量只需25 μL,不仅可以实现低至0.05 pg/mL检测限的高灵敏度蛋白分析,还可以通过点阵技术,在石墨电极板里实现每孔同时检测10个指标、4个数量级的宽动态检测范围[62]。因此,MSD技术常用于检测血液中的微量蛋白质生物标志物[63]。

2.3免疫沉淀联合质谱分析技术(IP-MS) IP-MS在分析外周血AD生物标志物中表现出广阔的应用前景[13-14]。该方法首先通过免疫沉淀技术,利用抗体的特异性亲和力,从丰富的血浆蛋白中分离和富集靶标蛋白及内标蛋白,然后利用质谱仪检测靶标蛋白水平,对质谱结果的内标蛋白信号进行归一化处理,最终换算得到靶标蛋白水平。如在SCHINDLER等[13]研究中,利用IP-MS实现了血浆Aβ的高灵敏度分析,其具体原理如下:来源于人体内的天然Aβ包含有14N同位素标记的氨基酸,将一定浓度15N标记的内标Aβ加入待测血浆中,利用免疫沉淀分离富集靶标蛋白Aβ,然后利用质谱仪检测靶标蛋白Aβ,得到Aβ同工型(Aβ38、Aβ40和Aβ42)的每个同位素(14N和15N)的质谱图,对所选靶标蛋白的离子峰面积进行求和。Aβ42水平计算公式为:14N同位素标记的Aβ42离子峰面积总和除以15N同位素标记的Aβ42离子峰面积总和乘以15N标记的内标Aβ42水平,用同样的方法计算Aβ40水平。最终得到的Aβ42/Aβ40比值可用于脑淀粉样变性的预测。

3 小 结

本文探讨了一系列存在于外周血中的AD早期标志物及其高灵敏度分析方法。在众多生物标志物中,研究最广泛且最有可能成为未来AD早期诊断发展方向的标志物有Aβ42/Aβ40、特定位点P-tau蛋白(P-tau181、P-tau217、P-tau231)及NLF。其中,Aβ42/Aβ40可以很好地反映大脑中淀粉样蛋白状态,特定位点P-tau蛋白在区分AD和其他神经退行性疾病上具有独特的优势,NFL在预测病情发展及药物试验预后监测中具有很好的诊断效果。此外,近年来超灵敏蛋白分析技术的快速发展,使得外周血中多种极低含量生物标志物的准确联合检测成为可能,这对于实现AD早期诊断具有非常重要的临床意义。

虽然有关AD患者外周血中生物标志物的研究已经取得了一系列成果,但仍存在一些亟须解决的问题:(1)由于样本数量受限,部分研究中生物标志物的准确性还未被广泛充分验证,仍需要扩大样本量继续进行研究验证;(2)部分研究时间不够,需要继续密切关注患者疾病发展情况,进行多年纵向研究;(3)需要更多的研究来确定如何最优地结合多种生物标志物进行综合分析,如Aβ42/Aβ40、P-tau、NFL及其他生物标志物或结合个体突变基因、认知测试进行系统分析;(4)每个实验室所使用的血液样本处理操作程序和标志物检测手段不同,需要统一操作程序和检测方法,提高研究结果的重复性和可靠性。

外周血中AD相关生物标志物研究正在朝着临床应用发展,但明确AD不同发展阶段、各个生物标志物的临床诊断临界值,并应用于AD早期诊断仍有很长一段路要走。相信随着AD生物标志物研究的更加深入及检测技术和评估方案的进一步提升,AD血液生物标志物在AD早期诊断和干预、抗AD药物研发、预后等方面将体现出广阔的应用前景。