miR-150-5p、miR-135b在糖尿病肾病患者中的表达及意义

马利军 刘占军 韩继明

1延安大学附属医院检验科，延安 716000；2延安大学医学院，延安 716000

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是2型糖尿病（diabetes mellitus type 2，T2DM）主要并发症，表现为持续性蛋白尿、血压升高，若未积极处理，极易演变为终末期肾病（end stage renal disease，ESRD），5年生存率不足50.0%［1-2］。因此，需深入了解DN发病机制，寻找新的诊疗靶点，重点干预其发病关键环节，延缓疾病进展，促进预后良好转归。微小核糖核酸（miRNA）属于小分子非编码RNA，可通过抑制靶基因mRNA参与生物体病理及生理过程［3］。相关研究表明，DN患者肾脏组织及外周血可见miR-150-5p、miR-135b等特异性miRNA表达，其水平升高与肾脏损伤有关，或可反映尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion rates，UAER）、预后情况［4-5］。本研究对外周血miR-150-5p、miR-135b与UAER、预后关系展开讨论分析，以期为DN患者病情及预后评估提供科学依据，现将结果报道如下。

资料与方法

1.临床资料

采用前瞻性研究方法，选取2019年1月至2021年10月延安大学附属医院收治的85例DN患者作为DN组，另纳入76例单纯T2DM患者作为T2DM组，80例健康体检者作为对照组。3组性别、年龄、体重指数比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

表1 3组临床资料比较

本研究经延安大学附属医院医学伦理委员会审批通过（S-S20230007）。

2.选取标准

⑴纳入标准。符合T2DM诊断标准［6］：伴有多尿、不能解释体质量下降、多饮，任意血糖≥11.1 mmol/L或空腹血糖≥7.0 mmol/L；符合DN诊断标准［7］：两次晨尿尿蛋白肌酐比≥25 mg/g，3次UAER平均值20～200 μg/min，血肌酐＜265 μmol/L；年龄≥18岁；患者知晓并签署知晓同意书；⑵排除标准：其他肾脏疾病；妊娠或哺乳期；近3个月内服用肾毒性药物；1型糖尿病；临床资料缺失，且依从性低下。

3.方法

⑴miR-150-5p、miR-135b检测：入院后1～2 d，采集2 ml清晨空腹外周肘静脉血，室温下离心15 min（2 500 r/min，离心半径6 cm），吸取400 μl上层血清，转移至新离心管中，-80℃保存。应用美国ABI公司7500型荧光定量酶标仪进行实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR），PCR总反应体系为15 μl，反应条件为16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85℃ 5 min。扩增条件为95℃ 10 min一个循环，95℃ 15 s、60℃ 60 s 45个循环，重复3次，各个反应体系中荧光信号达到设定阈值经历的循环数为Ct值，U6为内参照，采用2-△△Ct法计算miR-150-5p、miR-135b相对表达水平，△Ct=Ct目的基因-Ctu6。⑵UAER评价：根据翟莎娜等［8］文献将UAER分为＜30 mg/24 h、30～300 mg/24 h、＞300 mg/24 h 3个等级。⑶预后评价：DN患者均接受降糖、限制蛋白摄入量、降低尿蛋白等治疗。治疗后12个月采用门诊或电话随访，肾小球滤过率（GFR）＜15 ml·min-1·1.73 m-2为发生ESRD。

4.观察指标

⑴3组外周血miR-150-5p、miR-135b水平。⑵DN组不同UAER患者外周血miR-150-5p、miR-135b水平。⑶外周血miR-150-5p、miR-135b水平与UAER相关性。⑷不同预后患者外周血miR-150-5p、miR-135b水平。⑸外周血miR-150-5p、miR-135b水平预测DN并发ESRD价值。⑹外周血miR-150-5p、miR-135b水平对DN并发ESRD危险度的影响。

5.统计学方法

应用SPSS 22.0处理数据，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用SNK-q检验，计数资料以率（%）表示，行χ2检验，Spearman分析外周血miR-150-5p、miR-135b水平与UAER相关性，绘制受试者操作特征曲线（ROC）及曲线下面积（AUC），分析外周血miR-150-5p、miR-135b水平预测DN并发ESRD价值，采用相对危险度（RR）及其95%置信区间（CI）分析外周血miR-150-5p、miR-135b水平对DN并发ESRD危险度的影响。P＜0.05表明差异有统计学意义。

结果

1.外周血miR-150-5p、miR-135b水平比较

外周血miR-150-5p、miR-135b水平DN组＞T2DM组＞对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表2。

表2 3组外周血miR-150-5p、miR-135b水平比较（±s）

表2 3组外周血miR-150-5p、miR-135b水平比较（±s）

注：DN组为糖尿病肾病患者，T2DM组为2型糖尿病患者，对照组为健康体检者；DN为糖尿病肾病，T2DM为2型糖尿病

miR-135b 3.96±0.51 1.24±0.48 0.66±0.12 1 519.26＜0.001组别DN组T2DM组对照组F值P值例数85 76 80 miR-150-5p 3.36±0.68 1.03±0.62 0.78±0.21 560.11＜0.001

2.DN组不同UAER患者外周血miR-150-5p、miR-135b水平比较

DN组UAER＞300 mg/24 h患者外周血miR-150-5p、miR-135b水平＞UAER 30～300 mg/24 h患者＞UAER＜30 mg/24 h患者，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表3。

表3 DN组不同UAER患者外周血miR-150-5p、miR-135b水平比较（±s）

表3 DN组不同UAER患者外周血miR-150-5p、miR-135b水平比较（±s）

注：DN为糖尿病肾病，UAER为尿白蛋白排泄率

项目UAER＜30 mg/24 h UAER 30～300 mg/24 h UAER＞300 mg/24 h F值P值例数27 38 20 miR-150-5p 2.73±0.51 3.42±0.64 4.10±0.92 23.53＜0.001 miR-135b 3.02±0.49 3.87±0.61 5.40±0.87 78.25＜0.001

3.外周血miR-150-5p、miR-135b水平与UAER相关性

Spearman相关性分析显示，DN患者外周血miR-150-5p、miR-135b水平与UREA呈正相关（r=0.783、0.835，均P＜0.001）。见图1、图2。

图1 糖尿病肾病患者外周血miR-150-5p与UAER相关性（85例）

图2 糖尿病肾病患者外周血miR-135b水平与UAER相关性（85例）

4.不同预后患者外周血miR-150-5p、miR-135b水平比较

治疗后12个月随访，85例DN患者2例因地址更换失访，3例因电话号码更换失访，15例发生ESRD［18.75%（15/80）］。发生ESRD患者外周血miR-150-5p、miR-135b水平均高于未发生ESRD患者，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表4。

表4 糖尿病肾病患者不同预后外周血miR-150-5p、miR-135b水平比较（±s）

表4 糖尿病肾病患者不同预后外周血miR-150-5p、miR-135b水平比较（±s）

注：ESRD为终末期肾病

项目发生ESRD未发生ESRD t值P值例数15 65 miR-150-5p 4.41±0.55 3.14±0.38 10.67＜0.001 miR-135b 4.67±0.61 3.81±0.42 6.53＜0.001

5.外周血miR-150-5p、miR-135b水平预测DN并发ESRD价值

ROC显示，外周血miR-150-5p预测DN并发ESRD的AUC为0.733（95%CI0.623～0.826），截断值为3.49，敏感度及特异度分别为53.33%、87.69%；外周血miR-135b预测DN并发ESRD的AUC为0.829（95%CI0.729～0.904），截断值为4.38，敏感度及特异度分别为66.67%、90.77%；两者联合预测DN并发ESRD的AUC为0.944（95%CI0.868～0.983），敏感度及特异度分别为86.67%、87.69%。见图3。

图3 DN患者外周血miR-150-5p、miR-135b水平预测DN并发ESRD的ROC（85例）

6.外周血miR-150-5p、miR-135b水平对DN并发ESRD危险度的影响

以ROC获取外周血miR-150-5p、miR-135b水平最佳截断值为界分为高水平和低水平，经RR假设检验，可认为外周血miR-150-5p、miR-135b高水平和低水平对DN并发ESRD的RR均有统计学意义（U=2.133、2.895，P=0.033、0.004）。外周血miR-150-5p、miR-135b高水平患者并发ESRD的RR分别为低水平的3.619倍、10.889倍。见表5。

表5 外周血miR-150-5p、miR-135b水平对DN并发ESRD危险度的影响

讨论

DN发病率是糖尿病总人数的20.0%～40.0%，典型病理特征是肾小管基底膜及肾小球基底膜增厚、肾小球间质纤维化、肾小球系膜区细胞外基质进行性堆积，综合作用下诱发蛋白尿，甚至肾功能衰竭［9-11］。DN发病机制迄今未明，深入探究其发病机制对确定合理防治措施，促进预后改善意义重大［12-13］。

近年miRNA在DN诊断及疗效评估中发挥重要作用，其在DN中的靶向调控作用有望成为新型治疗靶点。因此，有必要了解DN患者体内miRNA种类及表达情况［14-16］。miR-135b最初多用于肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌鉴别诊断，相关研究发现其在肾脏疾病中存在过量表达，且表达主要位于肾小管上皮细胞及肾小球系膜细胞，提示其可能参与肾脏疾病发病过程［17-18］。田霖林等［19］指出，DN患者外周血miR-135b水平高于健康体检人群，推测与其调控Smad5基因促进系膜细胞增殖及肾脏纤维化有关，本研究结果与其一致。与上述研究不同的是，本研究采用UREA来评价肾功能损伤程度，UREA水平升高提示肾功能损伤程度相对严重［20-21］。统计分析发现，外周血miR-135b水平随UAER升高而升高，可见下调miR-135b水平有望延缓肾损伤，控制DN进展。随访发现，ESRD患者外周血miR-135b水平高于非ESRD患者，具有ESRD预测价值，与吴忠璟等［22］观点相近。推测原因为，高miR-135b具有细胞毒性，可诱发肾小管萎缩、间质纤维化、间质炎症等一系列病变，加剧DN病情进展，最终导致其演变为ESRD。进一步研究表明，miR-135b高水平患者并发ESRD的RR是低水平的10.889倍，95%CI1.503～78.872，充分佐证miR-135b参与DN病情进展和恶化，抑制miR-135b表达有望成为DN治疗新靶点之一。

miR-150主要功能为抑制恶性肿瘤增殖分化、促进微血管内皮细胞迁移、减少Ⅰ型胶原纤维含量，尤适用于淋巴细胞相关性恶性肿瘤及免疫性疾病鉴别诊断［23］。有研究发现，高浓度miR-150可通过细胞因子信号传导阻碍蛋白1上调促纤维因子表达，诱发肾组织纤维化病变，可作为肾脏纤维化生物标志物之一［24］。miR-150-5p是由miR-150前体的5，端臂加工而来，结构、功能相似。笔者推测miR-150-5p可能参与DN发生发展的整个病理过程。统计分析发现，DN组外周血miR-150-5p水平＞T2DM组＞对照组（均P＜0.05），说明miR-150-5p与DN发病有关，与杨翠伶［25］研究结论相近。外周血miR-150-5p水平与UREA呈正相关，考虑原因与DN患者存在长期血糖异常状态有关，极易损伤内皮功能，导致血管收缩，引起肾脏损害，而随着肾脏损害程度加重，与之相关的miR-150-5p水平表达异常升高，形成恶性循环，增加ESRD发生风险。目前，关于DN患者miR-150-5p的研究多集中于疾病预测或病情评估，鲜少报道miR-150-5p水平与DN预后关系［22-24］。本研究对此展开讨论分析，发现外周血miR-150-5p预测DN并发ESRD的AUC为0.829，miR-150-5p高水平患者并发ESRD的RR是低水平的3.619倍，95%CI1.105～11.856，临床可将外周血miR-150-5p作为DN并发ESRD的重要预测指标，有利于降低ESRD发生率。另外，外周血miR-150-5p、miR-135b单一预测DN并发ESRD价值仍存在一定局限性，故本研究拟尝试探讨两者联合预测价值，发现联合预测DN并发ESRD的AUC达0.944，优于各指标单一预测，可为临床早期预测ESRD提供有利参考信息。

综上所述，外周血miR-150-5p、miR-135b水平与DN患者UAER呈正相关，联合检测可作为预测DN并发ESRD的重要辅助手段，为临床诊治提供可靠数据支持。但本研究样本量偏少，随访时间过短，今后需扩大样本量，增加随访时间进行更为深入研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明马利军：研究设计与实施、采集数据、文章撰写、对文章的知识性内容作批评性审阅、统计分析；刘占军：研究设计与实施、采集数据、文章修改、统计分析；韩继明：研究设计、对文章的知识性内容作批评性审阅、指导