高效液相色谱法测定罗望子胶的单糖组成

王宝群，赵晓琳，林莎莎，邹圣灿，刘桂亭

(青岛琛蓝海洋生物工程有限公司，山东 青岛 266100)

罗望子多糖胶是一种从豆科罗望子属植物罗望子(又称酸角)的种子胚乳中提取分离出来的中性聚多糖，主要由葡萄糖、木糖和半乳糖三种单糖组成[1-3]。作为一种植物来源的多糖，其具有来源广泛、价格低廉、安全无毒等优点，所以被广泛使用。目前，罗望子多糖胶已被广泛使用于食品行业，主要用作冰淇淋增稠剂、饮料悬浮剂、淀粉品质改良剂、果冻和糕点胶凝剂等。此外，其在医药、保健、纺织等行业的应用也被广泛关注[4-7]。

高效液相色谱法(HPLC)作为一种高效准确的检测方法，已被广泛应用于分析多糖中单糖组成和含量[8-12]。但是由于单糖组分的光学性质普遍较差，所以常常需要用具有强紫外吸收的PMP试剂对单糖物质进行衍生后再进行检测，从而提高HPLC法的灵敏度[13]。PMP柱前衍生化高效液相色谱法具有灵敏度高、稳定性好、重复性好、数据准确、设备操作简便等优点[14-15]，因此采用该方法分析罗望子多糖胶中葡萄糖、木糖和半乳糖三种单糖组分的比例。此外，多糖水解采用的酸化试剂通常为三氟乙酸，但是三氟乙酸属于弱酸，水解能力较弱，有时会造成水解不彻底的现象，所以采用强酸硫酸作为酸化试剂，以确保多糖能够充分水解。综上，采用硫酸水解-PMP柱前衍生化高效液相色谱法检测罗望子多糖胶的单糖组分含量，为其准确检测提供方法和依据。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

LC-20AT型液相色谱仪、SPD-M20A 230V型光电二极管阵列紫外可见光检测器，安捷伦有限公司；色谱柱(Diamonsil-plus C18-A*)，北京迪马科技有限公司；101-1A型电热恒温鼓风干燥箱，上海沪越明科技仪器有限公司；AR224CN型电子天平，奥豪斯仪器(常州)有限公司；Master-E plus UF型实验室纯水系统，上海和泰仪器有限公司；DK-98-ⅡA型电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；XW-80A型旋涡振荡器，上海沪西分析仪器厂有限公司；PHS-3E型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司。

罗望子多糖胶，安徽舒俊生物科技有限公司；D-葡萄糖、D-木糖和D-半乳糖标准品，上海源叶生物科技有限公司；PMP，麦克林生物科技有限公司；硫酸、盐酸、磷酸、氢氧化钠、甲醇、二氯甲烷、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠，国药集团化学试剂有限公司；乙腈，赛孚瑞科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 磷酸盐缓冲液配制

配制50 mmol/L磷酸二氢钾和50 mmol/L磷酸氢二钠溶液，将两者按体积比1∶1混合，然后用2 mol/L NaOH调节pH至6.8。

1.2.2 罗望子多糖胶样品水解

称取10 mg罗望子多糖胶样品于顶空瓶中，加入1 mol/L H2SO4溶液2 mL，密封后放置于100 ℃烘箱酸解6 h。取出后冷却，开封。向溶液加入2 mol/L NaOH溶液2 mL，涡旋振荡器混匀。将溶液过0.22 μm滤膜。

1.2.3 标准品溶液配制

分别称取葡萄糖标准品27 mg、木糖标准品29 mg和半乳糖标准品33 mg，放置于同一250 mL容量瓶中，用水定容后将溶液混匀。

1.2.4 衍生

取0.3 mL待测溶液于10 mL离心管中，加入0.3 mL 0.5 mol/L PMP-甲醇溶液，加入0.3 mol/L NaOH溶液0.5 mL。将溶液用涡旋振荡器混匀后，在70 ℃水浴衍生30 min。冷却，加入0.3 mol/L盐酸0.3 mL进行中和。然后用二氯甲烷萃取多余衍生剂，每次1 mL，重复3次，直至二氯甲烷层无色。上清液过0.22 μm滤膜后置于色谱瓶中。

1.2.5 色谱条件

色谱柱为Diamonsil-plus C18-A*型(4.6 mm×50 mm，5 μm)，流动相为50 mM磷酸盐缓冲液(pH6.8)∶乙腈=82∶18的混合溶液，进行等度洗脱。检测波长为245 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为35 ℃，采集时间为45 min。

1.2.6 进样检测

将样品溶液进样体积设置为5.0 μL，标准溶液进样体积依次设置为0.3、0.5、1.0、3.0和5.0 μL，进行HPLC测定，记录峰面积。按标准曲线法计算样品中三种单糖葡萄糖、木糖和半乳糖的含量。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 流动相比例的确定

选定50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.8)-乙腈流动相体系，调节流动相中乙腈比例分别为16%、17%、18%、19%和20%。结果如图1所示，随着流动相中乙腈比例的降低，各色谱峰间的分离度有所提高，但是当乙腈比例过低时，各色谱峰的保留时间较长。从色谱峰的分离度及保留时间两个方面综合考虑，确定流动相条件为50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.8)∶乙腈的比例为82∶18。

图1 流动相中乙腈比例对各单糖分离效果的影响Fig.1 Effect of acetonitrile ratio of mobile phaseon the separation of monosaccharides

2.1.2 流动相pH的确定

选定50 mmol/L磷酸盐缓冲液：乙腈比例为82∶18的流动相体系，调节磷酸盐缓冲液的pH分别为6.4、6.6、6.8、7.0和7.2。结果如图2所示，随着磷酸盐缓冲液pH的降低，各色谱峰间的分离度逐渐提高，各色谱峰的保留时间延长。综合分析色谱峰的分离度及保留时间，确定50 mmol/L磷酸盐缓冲液的pH为6.8。

图2 流动相pH值对各单糖分离效果的影响Fig.2 Effect of pH value of mobile phase on the separation of monosaccharides

2.1.3 柱温的确定

调节柱温分别为25、30、35、40和45 ℃。结果如图3所示，随着柱温升高，色谱峰的保留时间逐渐缩短。但当柱温过高时，色谱峰的分离度呈下降趋势。结合色谱峰的分离度及保留时间两因素考虑，确定柱温为35 ℃。

图3 柱温对各单糖分离效果的影响Fig.3 Effect of column temperature on separation of monosaccharides

2.2 样品检测

选取三批相同来源的罗望子多糖胶样品进行检测，色谱谱图如图4所示。对检测数据采用标准曲线法进行计算计算，确定各检测样品中三种单糖葡萄糖、木糖和半乳糖的组成，结果如表1所示。结果表明，罗望子多糖胶样品中含有葡萄糖、木糖和半乳糖三种单糖，葡萄糖含量最高，木糖次之，半乳糖含量最低，三者的所占比例分别为52.05%、20.03%和12.17%。

表1 罗望子多糖胶中三种单糖的含量Table 1 Contents of three monosaccharides in tamarind polysaccharide gum

图4 罗望子多糖胶的色谱图Fig.4 Chromatogram of tamarind polysaccharide gum

2.3 色谱方法学验证

2.3.1 线性关系和检出限

将标准品溶液衍生化，进样体积分别设置为0.1、0.2、0.3、0.5、1、3、5、10和15 μL，上机进行检测，记录各色谱峰的峰面积。在进行数据处理时，以各单糖标准品的峰面积为纵坐标(y)，质量浓度为横坐标(x)，绘制线性回归曲线。采用信噪比S/N=3的公式计算检测限，结果如表2所示。结果表明，三种单糖的相关系数在0.999 2～0.999 9之间，检出限在0.004 3～0.005 6 mg/L之间，说明三种单糖在线性范围内具有良好的线性关系，并且仪器具有较高的灵敏度。

表2 三种单糖的标准曲线方程、相关系数、线性范围和检出限Table 2 Standard curve equations，correlation coefficients，linear rangesand detection limits of the three monosaccharides

2.3.2 精密度

取同一标准品溶液进行上机测定，连续测定6次，计算各单糖色谱峰RSD值。数据表明，三种单糖葡萄糖、木糖和半乳糖的峰面积RSD值分别为0.64%、0.85%和0.62%，说明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性

取同一样品待测液，分别在制备后0、3、6、9、12、24 h上机进行测定，计算各单糖色谱峰RSD值。数据表明，三种单糖葡萄糖、木糖和半乳糖的峰面积RSD值分别为1.22%、1.06%和0.96%，说明样品待测液在24 h内具有良好的稳定性。

2.3.4 加样回收率

取已知含量的罗望子多糖胶样品水解液于具塞试管中，准确加入一定量葡萄糖、木糖和半乳糖标准品，进行衍生，平行制备6份，制得的待测液上机检测。根据公式回收率=(加标试样测定值-试样测定值)/ 加标量×100%，计算加样回收率，结果如表3所示。结果表明，三种单糖葡萄糖、木糖和半乳糖的加样回收率在100.33%～101.34%之间，RSD 值小于2.0%，说明该分析方法准确度良好。

表3 三种单糖的加样回收率Table 3 Recovery rates of three monosaccharides

3 结 论

本研究建立 PMP柱前衍生化高效液相色谱法，同时检测罗望子多糖胶中三种单糖葡萄糖、木糖和半乳糖的组成比例。以罗望子多糖胶为原料，经硫酸水解、PMP衍生化后进行单糖组成测定。结果表明样品中同时含有葡萄糖、木糖和半乳糖三种单糖，组成分别为52.05%、20.03%和12.17%。实验表明，该方法具有较高的灵敏度和准确度，结果稳定可靠，可满足罗望子多糖胶中单糖组成分析和含量测定的要求，可为罗望子多糖胶的质量控制提供分析方法和科学依据。