姜黄素通过调节SIRT3/FOXO3a 通路改善糖尿病心肌病的机制研究

李 星，钟 毅，陈 雪

（西南医科大学附属医院心血管内科，四川 泸州 646000）

糖尿病患病率是全球增长最快的疾病之一［1］，糖尿病相关的心血管并发症是其高死亡率的重要原 因，糖 尿 病 心 肌 病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病心血管并发症中的一种独立疾病，以心肌纤维化、心脏舒张功能障碍、心室重塑为特点［2］。在过去的几十年中，糖尿病性心肌病相关研究呈指数级增长，但其发病机制仍不清楚。

氧化应激是糖尿病心肌病的重要发病机制之一，高 血 糖 和 糖 化 终 产 物（advanced glycation end products，AGE）会刺激细胞内活性氧（reactive oxygen species， ROS）的产生，增强氧化应激，因此抑制氧化应激是预防和治疗DCM 的重要策略［3］。SIRT3（silence information regulator 3， SIRT3）属于sirtuins 家族，是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide， NAD+）依赖性蛋白质去乙酰酶［4］。心肌细胞发生氧化应激时SIRT3 通过去乙酰化并激活叉头转录因子O3a（forkhead box O3a-dependent，FOXO3a），减少ROS 的生成，抑制氧化应激［5］。姜黄素作为一种多作用靶点的酚类化合物，拥有良好的抗炎及抗氧化应激作用，可改善糖尿病心肌病变［6］。目前对于姜黄素在糖尿病心肌病的保护作用与SIRT3/FOXO3a 信号通路之间的关系尚不明确。基于此，本研究通过糖尿病心肌病小鼠动物模型，探究姜黄素对糖尿病心肌病小鼠保护作用及SIRT3/FOXO3a 信号通路的影响，为姜黄素临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

20 只健康雄性C57 BL/6 小鼠，SPF 级，6～8 周龄，约18 g/只，均购于西南医科大学实验动物中心，SCXK（川）2018-17，饲养条件符合实验动物管理与使用指南，所有操作遵循西南医科大学动物实验操作规范，实验期间小鼠可自由取食和饮水，本次实验已通过西南医科大学实验动物福利与伦理审理（批准文号：swmu2023022），姜黄素购于上海迈瑞尔化学技术公司（458-37-7|M17074-100G），小鼠普通饲料购于西南医科大学实验动物中心，高糖高脂饲料购于小黍有泰（北京）生物科技有限公司（XSYT-ED-074），链脲佐菌素（sreptozocin，STZ）购于北京索莱宝科技有限公司（S8050-100mg），tunel试剂盒购自武汉塞维尔公司（G1504）丙二醛（MDA）测定试剂盒（A003-1）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX ）测试盒（A005-1）超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（A001-3）、活性氧（ROS）测定试剂盒（E004-1）购自南京建成，BAX 抗体（#2772）、SIRT3 抗体（#5490）购自美国CST 公司，FOXO3a抗体购自武汉三鹰生物科技公司；Bcl-2 抗体（ab196495）购自英国Abcam，Cleaved caspase-3 抗体购自美国Affinity Biosciences 公司；cDNA 合成试剂 盒（EQ031）、PCR 反 应 试 剂 盒（EQ001）购 自ELK Biotechnology。

1.2 方法

1.2.1 动物造模及分组 20 只小鼠适应性喂养一周后，随机取15 只小鼠为造模组，予以高糖高脂饮食，再随机取5 只小鼠为空白组继续普通饲料喂养，直至实验结束；一个月后将造模组小鼠连续5 d，禁食不禁水12 h 后腹腔注射STZ 溶液（60 mg/kg），分别于造模结束后第7 日，第10 日，第14 日测量尾静脉随机血糖，均高于16.7 mmol/L，出现多饮、多食、多尿、体重下降为造模成功。空白组同样禁食不禁饮后腹腔注射等容量的生理盐水；造模组小鼠随机等量分为糖尿病DCM 组、低剂量姜黄素组（LC组），高剂量姜黄素组（HC 组），姜黄素高、低剂量组分别灌胃姜黄素溶液（将姜黄素按照200 mg/kg，100 mg/kg 两种剂量与生理盐水分别配伍成 1mL溶液）。连续灌胃12 周，每天一次；DCM 组灌胃等量生理盐水。

1.2.2 苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin，HE）小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，处死，生理盐水灌流后取心脏，取适量小鼠心肌组织，固定包埋后制成厚度约为4 µm 的切片，行常规 HE 染色；苏木精染液使细胞核着蓝紫色；伊红使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。

1.2.3 蛋白印迹（Western-blot，WB） 用RIPA 总蛋白裂解液将研磨后的组织块中总蛋白提取后，用BCA 蛋白质浓度测定试剂盒测定上清液中蛋白浓度，每组按20 µg 蛋白溶液体积上样，SDS-PAGE 电泳分离蛋白，转印至 PVDF 膜，将转好的膜加入封闭液室温封闭1 h，加入BAX 抗体（1∶2 000）、SIRT3（1∶2 000）、FOXO3a（1∶500）、Bcl-2（1∶1 000）、Cleaved caspase-3 抗 体（1∶500），4 ℃孵 育 过 夜，TBST 洗涤3 次，加入二抗，于室温孵育30 min；孵育后洗膜、曝光、显影。AlphaEaseFC 软件处理系统分析目标带的光密度值。

1.2.4 荧光定量PCR 从小鼠心肌组织中提取总RNA，并合成cDNA。PCR 反应程序如下：在 95 ℃预变性30 s 激活酶后，进行40 次PCR 循环（95 ℃条件下变性 10 s，58 ℃条件下退火30 s，72 ℃条件下延伸30 s），各引物序列见表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.2.5 TUNEL 染色 根据TUNEL 试剂盒说明书的步骤将将小鼠心脏组织的石蜡切片进行染色及片，检测各组小鼠心脏的组织切片中的细胞凋亡情况；显微镜下以随机5 个视野中阳性细胞百分率计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.6 心脏超声检测 用吸入乙醚麻醉小鼠，前胸脱毛后固定在操作台上，超声心动仪检测小鼠心功能，记录超声心动图参数：左心室舒张阶段末期内径（LVEDd）、左心室射血分数（LVEF），舒张期左室后壁厚度（LVPWd），每个测量值，取3 个心动周期的测量平均值。

1.2.7 心肌组织中GSH-PX 、SOD 活力及MDA 含量检测 取心肌组织块，漂洗、剪碎后，研磨为组织匀浆后，分别按照试剂盒要求检测GSH-PX、SOD活力及MDA 含量。

1.2.8 心肌组织ROS 水平检测 将心肌组织放入PBS 溶液中漂洗、剪碎、再次漂洗，加入酶消化液中消化后过滤、离心，取沉淀再次PBS 洗2 次后按照试剂盒要求，利用DCFH-DA 检测细胞内ROS 水平。

1.3 统计学处理

采用SPSS 25.0 统计软件对数据进行分析。经检验，所有计量资料符合正态分布，用（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析比较，两组间比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组的心脏结构及功能指标

将各组小鼠干预12 周后，将小鼠麻醉后行心脏彩超检测其心脏结构情况及功能指标如表2 所示：与Con 组相比，DCM 组舒张期左室后壁厚度（LVPMd）、舒 张 期 左 室 容 积（LVIDd）明 显 增 大（P＜0.05），射血分数（EF）明显减小（P＜0.05），差异有统计学意义；而姜黄素组与模型组相比LVPMd、EF、LVIDd 均明显改善（P＜0.05），且HC 组较LC组改善更明显（P＜0.05）。

表2 各组小鼠心脏彩超数据（n=5，±s）Tab 2 Cardiac ultrasound data of mice in each group（n=5，±s）

表2 各组小鼠心脏彩超数据（n=5，±s）Tab 2 Cardiac ultrasound data of mice in each group（n=5，±s）

注：与Con 组比较,aP＜0.05；与DCM 组比较；bP＜0.05；与LD组相比，cP＜0.05。

LVIDd（mm）3.72±0.20 3.55±0.06a 3.53±0.15b 3.81±1.43c 12.306组别Con 组DCM 组LC 组HC 组F LVPMd（mm）0.58±0.04 0.75±0.02a 0.66±0.04b 0.65±0.08c 11.818 EF（%）65.67±1.52 57.7±3.9a 63.11±1.34b 64.58±1.13c 4.548

2.2 各组TUNEL 染色细胞凋亡情况

如图一及表3所示，Con组中仅有少量细胞凋亡，与Con组相比，而DCM 组小鼠心肌细胞凋亡明显，差异有统计学意义（P＜0.05）；而与DCM 组相比，LC组、HC组明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 各组小鼠心肌细胞TUNEL 染色细胞凋亡情况（n=3，±s）Tab 3 Apoptosis of TUNEL-stained mice cardiomyocytes in each group（n=3，±s）

表3 各组小鼠心肌细胞TUNEL 染色细胞凋亡情况（n=3，±s）Tab 3 Apoptosis of TUNEL-stained mice cardiomyocytes in each group（n=3，±s）

注：与Con 组比较,aP＜0.05；与DCM 组比较，bP＜0.05；与LD组相比，cP＜0.05。

细胞凋亡率（%）1.13±0.19 73.42±12.8a 47.7±8.87b 27.26±5.35c 41.62组别Con 组DCM 组LC 组HC 组F

2.3 各组心肌组织病理形态表现

如图2 所示，光镜下观察小鼠心肌，相较于Con组，DCM 组心肌细胞间质水肿，细胞核排列紊乱，心肌纤维断裂明显，可见核固缩，而LC 组及HC 组相较于DCM 组，心肌病理变化有所改善。

图1 各组小鼠心肌细胞凋亡情况（×400）Fig 1 Apoptosis of cardiomyocytes in mice of four groups（×400）

2.4 各组的氧化应激标志物水平

如图3 所示，与空白组相比，模型组中的GSHpx、SOD 活力降低，MDA 含量及ROS 水平升高（P＜0.05）：与模型组相比，LC 组、HC 组中的GSHpx、SOD 活 力 显 著 升 高，MDA 含 量 及ROS 水 平 显著降低，且具有剂量相关性（P＜0.05）。

图3 各组小鼠心肌细胞的氧化应激标志物水平Fig 3 Levels of oxidative stress markers in cardiomyocytes of mice in the each group

2.5 各 组 的SIRT3、FOXO3a、Bcl2、Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表达情况

如图4 所示，与空白组相比，模型组SIRT3、FOXO3a、Bcl2 蛋白表达减少，Bax、Cleaved caspase-3 的表达增加（P＜0.05）；与模型组相比，LC 组和HC 组 的SIRT3、FOXO3a、Bcl2 的 表 达 增 加，Bax、Cleaved caspase-3 表达减少，且具有剂量相关性（P＜0.05）。

图4 各组小鼠心肌细胞中SIRT3、FOXO3a、Bcl2、Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表达情况Fig 4 Expression of SIRT3， FOXO3a， Bcl2， Bax， and Cleaved caspase-3 protein in cardiomyocytes of mice in each group

2.6 各 组 的SIRT3、FOXO3a 基 因mRNA 表 达情况

如图5 所示，与空白组相比，模型组小鼠心肌中的SIRT3、FOXO3a的表达明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，LC 组、HC 组小 鼠 心 肌 的SIRT3、FOXO3a的 表 达 增 加（P＜0.05），且随姜黄素剂量增加，SIRT3、FOXO3a表达逐渐增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图5 各组小鼠心肌细胞中SIRT3、FOXO3a 基因mRNA 表达情况Fig 5 Expression of mRNA in SIRT3 and FOXO3a genes in cardiomyocytes of mice in each group

3 讨论

糖尿病是威胁人类健康与生命最常见的疾病之一，且发病率逐年增加［7］。糖尿病心肌病是糖尿病的心血管并发症中的一种独立疾病，氧化应激反应是糖尿病心肌病发病的重要机制之一。高糖高脂环境下，过量的ROS 产生会导致氧化应激损伤、炎症反应、心脏肥大和纤维化，最终导致细胞死亡和心功 能障碍［8］。SIRT3/FOXO3a 通路是调节氧化应激的重要通路［9］，SIRT3/FOXO3a 通路可通过抑制NADPH 氧化酶、减少ROS 的过量产生、改善线粒体功能，抑制氧化应激［10］。在本次研究中，我们使用高糖高脂饮食结合STZ 干预的方式建立糖尿病心肌病模型，通过予以小鼠高、低两种姜黄素剂量的干预方式，去评估姜黄素对于糖尿病心肌病小鼠的心肌结构与功能、凋亡、氧化应激及SIRT3/FOXO3a 通路的影响，并探讨可能的作用机制。

姜黄素是作为一种古老的传统药物，因其良好的抗凋亡、抗氧化应激、抗衰老、副作用小等特质被研究人员广泛关注。大量研究表明姜黄素对DCM心肌细胞具有保护作用［11］。在本次研究中，DCM组小鼠心脏彩超结果：LVPMd、LVIDd 明显增大，EF 值明显降低，提示模型组小鼠出现心肌收缩与舒张功能减退，心肌肥厚。HE 染色提示：DCM 中小鼠的心肌纤维排列紊乱、疏松，心肌细胞肥大，病理结果符合DCM 病理改变。而经姜黄素高、低剂量组处理后心脏结构与功能，心肌损伤情况均有明显改善。TUNEL 染色结果也提示，姜黄素可有效减少DCM 小鼠心肌细胞的凋亡。这与Ren 等［12］的研究结果一致。

SIRT3 是一种NAD+依赖性去乙酰化酶，主要在线粒体中表达，研究表明，SIRT3 表达增加可能与人类长寿相关［13］。SIRT3 基因敲除的小鼠心肌细胞的线粒体中ATP 合成减少并出现心肌肥厚、纤维化及收缩功能减退［14］，另外，既往已有大量研究表明SIRT3 可抑制氧化应激，减轻炎症反应 ，保护心肌细胞，减轻心肌肥厚，改善心力衰竭［15-17］。Wang 等［18］的 研 究 中CD38 基 因 敲 除 的 小 鼠 可 通 过激活SIRT3/FOXO3 介导的抗氧化应激途径，保护心脏免受高脂饮食诱导的氧化应激。另外，也有研究表明脂肪因子Omentin1 可上调SIRT3/FOXO3a信号通路，激活线粒体自噬，从而改善心肌梗死诱导的心力衰竭和心肌损伤［19］。因此，本研究对姜黄素的DCM 小鼠心肌保护机制与SIRT3/FOXO3 信号通路是否有关进行探讨，本次研究表明：在DCM小鼠心肌组织中，SIRT3、FOXO3a基因表达情况明显降低，凋亡相关蛋白：Bax、Cleaved caspase-3 表达增多，SIRT3、FOXO3a、Bcl2 蛋白表达减少，GSHpx、SOD 活力降低，MDA 含量及ROS 水平升高，提示糖尿病心肌病小鼠SIRT3/FOXO3a 通路表达受抑，心肌细胞出现氧化应激损伤、细胞凋亡。既往已有研究表明SIRT3/FOXO3a 信号通路受抑可能在糖尿病心肌病的发展中起重要作用［20］。而经姜黄素干预后可逆转上述指标，增加SIRT3、FOXO3a的表达，提高GSH-px、SOD 水平，降低MDA 含量及ROS 水平，抑制氧化应激，保护心肌细胞，且呈剂量相关性。由此可见，姜黄素的心肌保护作用可能与提高SIRT3/FOXO3a 通路表达，从而抑制氧化应激，减少细胞凋亡有关。

综上所述，姜黄素可有效减轻DCM 小鼠的心肌肥厚，改善心脏结构及功能，减少心肌细胞凋亡，其机制可能与激活SIRT3/FOXO3a 通路，抑制心肌细胞氧化应激有关。

作者贡献度说明：

李星：参与课题设计、实验动物饲养、相关指标检测及论文写作；钟毅：参与课题设计及文章审校；陈雪：参与文章修改。

所有作者声明不存在利益冲突关系。