高效液相色谱法检测混合型饲料添加剂中绿原酸的优势及其影响因素

【摘要】绿原酸作为一种具备多种生理功能的活性物质在畜牧业中的应用越来越广泛。高效液相色谱法因分离能力强、灵敏度高、分析速度快、结果精确以及应用广泛等优点而备受青睐，成为绿原酸检测中最为常用的检测方法。本文阐述了高效液相色谱法测定混合型饲料添加剂中绿原酸含量的优势及注意事项，旨在为检测混合型饲料添加剂中的绿原酸含量提供一些新思路。

【关键词】绿原酸；高效液相色谱法；混合型饲料添加剂

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.02.002

Determination of Chlorogenic Acid in Mixed Feed Additives by HPLC and Its Influencing Factors

YANG Huijie

（Liaoning Inspection，Examination & Certification Centre〔Liaoning Lnstitute forAgro-product Veterinary Drugs and Feed Control〕， Shenyang 110036， China）

Abstract： Chlorogenic acid， as an active substance with various physiological functions， has been more and more widely used in animal husbandry. High performance liquid chromatography （HPLC） is favored for its excellent separation ability， high sensitivity， rapid analysis speed， accurate results and a wide range of applications， and is most commonly used in chlorogenic acid detection. In this paper， the advantages and precautions of determination of chlorogenic acid in mixed feed additives by high performance liquid chromatography （HPLC） were described， in order to provide some new ideas for the determination of chlorogenic acid in mixed feed additives.

Keywords： chlorogenic acid； HPLC； mixed feed additives

绿原酸（Chlorogenic acid，CA）是由咖啡酸（Caffeic acid）与奎尼酸（Quinicacid，1-羟基六氢没食子酸）生成的缩酚酸，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物[1]。绿原酸类物质来源广泛，具有重要的生物活性作用，如抗菌、抗病毒、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基等[2]。作为一种潜在的增强动物自身免疫力的饲料添加剂，绿原酸能够缓解动物肠道氧化应激和炎症，維持肠道稳态和免疫机能，保障动物肠道健康[3]。绿原酸不仅可有效提高动物生产性能，具有抗炎、抗氧化、提升机体免疫能力的优点[4-6]，还能作为替代饲用抗生素类的饲料添加剂，确保畜禽肉质安全优质，显著增强畜禽的抗病力。因此，在畜牧行业中绿原酸拥有广阔的应用前景。

1绿原酸的理化性质

绿原酸半水合物为白色或微黄色的针状结晶，其在110℃时会失去结晶水变为无水物，熔点为208℃。在25℃的条件下，绿原酸在水中的溶解度大约为4%。它易溶于如乙醇、丙酮和甲醇等极性溶剂，而在乙酸乙酯中的溶解度较小。同时，绿原酸难以溶解在三氯甲烷、乙醚和苯等亲脂性的有机溶剂中[7]。在结构上，绿原酸是由咖啡酸和奎尼酸结合形成的酯，其分子中包含酯键、不饱和双键以及多元酚这三个化学性质较为活跃的部分。因此，在从植物中提取绿原酸时，常常会因为水解和分子内酯基的迁移而导致绿原酸异构化。由于绿原酸具有特定的化学结构，我们可以利用极性溶剂如乙醇、丙酮、甲醇等从植物中提取绿原酸，但绿原酸并不稳定，所以应避免在高温、强光的环境下进行提取，并且不要长时间加热。

2高效液相色谱法检测混合型饲料添加剂中绿原酸的含量

绿原酸的检测方法很多，例如应用近红外光谱技术快速测定甜叶菊中绿原酸含量[8]，应用HPLC-MS/MS检测杜仲中绿原酸含量[9]，基于碳点为探针的荧光检测方法测定绿原酸含量[10]等。高效液相色谱法因分离效能高、灵敏度高、检测快速准确、应用范围广等优势，在绿原酸检测中得到广泛应用。

2.1高效液相色谱法检测混合型饲料添加剂中绿原酸含量概述

目前，针对混合型饲料添加剂中绿原酸含量的检测尚无国家标准。在实际检测过程中实验室基本采用企业提供的标准，以高效液相色谱法为主。该方法在不同的企业标准中虽不完全一致，但所采用的设备、试剂及检测条件基本一致。

2.1.1试剂和设备

甲醇（色谱纯），磷酸（优级纯），乙腈（色谱纯），绿原酸标准品（含量≥95.0%），高效液相色谱仪（配备紫外检测器或二极管阵列检测器），超声波清洗器，分析天平。

2.1.2色谱条件

色谱柱：长度为250 mm、内径为4.6 mm的C18柱或与之相当性能的色谱柱；流动相组成为乙腈和0.4%磷酸溶液，比例为15∶85；检测波长设定为327 nm。

2.1.3含量测定

1）标准品溶液制备

精密称取10 mg的绿原酸标准品，将称取的标准品放入一个10 mL的棕色量瓶中，然后加入50%的甲醇溶液，使其溶解，并确保准确定容，然后将量瓶中的溶液混合均匀，这样就得到了标准品储备液。再从标准品储备液中准确量取5 mL的溶液，并将其转移到一个50 mL的棕色容量瓶中，再次使用50%的甲醇溶液，将容量瓶中的溶液稀释至刻度线，并混合均匀，这样就得到了用于上机分析的标准品上机液。

2）试样溶液制备

称取适量混合型饲料添加剂（约相当于绿原酸2 mg），放入一个100 mL的棕色量瓶中，加入50%的甲醇溶液，并通过振摇使其充分溶解。待溶解完全后，使用50%的甲醇溶液将容量瓶中的溶液定容至刻线，然后将定容后的样品充分摇匀，以确其保混合均匀。最后，通过0.45μm的有机滤膜进行过滤灌瓶，即得试样溶液。

3）上机测定

分别将上述标准品上机液和试样溶液注入高效液相色谱仪进行测定。

4）结果计算

2.2高效液相色谱法测定混合型饲料添加剂中绿原酸含量的优势

2.2.1高效液相色谱法的自身优势

高效液相色谱法具有分离效果好、检测灵敏度高、分析速度快、定量准确、选择性好、自动化程度高和适用范围广等优势。好的分离效果可以有效地将绿原酸与其他化合物进行分离，避免干扰物质的影响，提高检测结果的准确性和可靠性；高灵敏度可以满足各种不同类型样品的分析需求；相比传统的检测方法，高效液相色谱法的分析速度更快，可以在短时间内完成大量样品检测，提高工作效率；高效液相色谱法可以提供准确的定量结果，通过对比标准品和样品的峰面积，可以确定样品中绿原酸的含量，这对混合型饲料添加剂中绿原酸的质量控制非常重要；好的选择性可以有效避免干扰物质的影响，从而更准确地测定绿原酸含量。

2.2.2试剂设备简单

高效液相色谱法检测绿原酸，常用的试剂主要包括甲醇（色谱纯）、磷酸（优级纯）、乙腈（色谱纯）、绿原酸标准品（含量≥95.0%）等，这些试剂在高效液相色谱分析中比较常用，相对容易获取。因此，从试剂的角度来看，高效液相色谱法检测绿原酸所用的试剂相对简单。而该方法所用设备有高效液相色谱仪（配备紫外检测器或二极管阵列检测器）、超声波清洗器、分析天平，这些设备均为实验室常规检测设备，操作相对简单。

2.2.3前处理方法简单

应用高效液相色谱法测定混合型饲料添加剂中绿原酸含量的前处理方法操作简便，只需通过甲醇提取，确保充分溶解、定容准确即可。全程操作简便快捷，无需净化、衍生化等复杂的前处理过程。另外，此方法因操作步骤少也减少了处理过程中绿原酸的损失。

3高效液相色谱法测定混合型饲料添加剂中绿原酸含量时的注意事项

尽管高效液相色谱法测定混合型饲料添加剂中绿原酸含量简便、易行，但忽视操作细节容易导致测定含量偏低、色谱峰型差、峰前延、峰拖尾甚至不出峰等情况发生。为了更好地应用液相色谱法开展混合型饲料添加剂中绿原酸的检测，我们总结了以下注意事项。

3.1样品的称量

在检测样品过程中，称量样品时要注意以下几点：一是精确度。称量样品时需要保证称量的精确度，以避免因称量误差导致实验结果不准确。二是避免污染。需要确保样品不被污染，这包括避免样品受到外界物质的干扰，如灰尘、杂质等，同时也需要确保称量器具的清洁和卫生。三是称量设备合格。一定使用检定合格的天平，且天平放置环境的温湿度等要符合相关规定。四是样品均匀性。称量前一定要充分混匀，且至少称量两组平行样品。

3.2色谱柱的选择

在色谱分析中色谱柱的选择是非常重要的。选择适合的色谱柱需要考虑多个因素，如分离度、柱效、稳定性、兼容性和价格等。测定绿原酸推荐使用耐酸范围宽的C18色谱柱。一方面，该类型色谱柱稳定性好、分离度高、柱效高；另一方面，该实验中采用的流动相含有磷酸溶液，pH值在1.8左右。色谱柱选择不当不仅影响检测结果，还会损坏色谱柱的填料，缩短色谱柱使用寿命。

3.3避光操作

绿原酸含有邻二酚羟基。这个结构使得绿原酸在受热、遇强光时容易发生氧化反应，影响检测结果的准确性，因此该实验需要在避光条件下进行。具体措施为：一是使用遮光窗帘或黑布遮盖实验台或整个实验室，以阻挡外界光源的照射；二是在实验室内使用黑色塑料袋或黑布，将需要避光的容量瓶等容器包裹起来，以避免受到光线的影响。

3.4预防交叉污染

同一台液相色谱仪，同一个色谱柱，如果既做绿原酸检测又做其他样品的检测，需要格外注意每次实验结束后的冲洗程序，建议低流速过夜清洗色谱柱，确保整个系统清洁完全后再进行下一次的实验。

3.5质控管理

在实验过程中很多因素会对实验结果产生影响，如仪器状态、试剂质量、实验人员的操作等。为了确保检测的准确性、稳定性和可靠性，每次检测时，实验人员可通过加标回收或质控样的方式来确保实验结果的稳定性，一旦实验过程中出现问题则立即进行调整，以保证检测结果的准确性。

4结束语

绿原酸作为一种天然植物提取物，具有环保、可持续等特点。在畜牧业中应用绿原酸，可有效减少对环境的污染和对资源的浪费，从而促进畜牧业的可持续发展。为了更加充分地发挥绿原酸的作用和优势，应进一步加强研究和实践，不断探索更好的检测方法、质量控制方案及其在畜牧业中的最佳应用方式等，以满足畜牧业发展的多样化需求。

【参考文献】

[1]陈芳，杜恩存，樊启文，等.绿原酸类物质在畜禽生产中的应用及研究进展[J].湖北农业科学，2020，59（21）：10-14.

[2]汪洪涛.绿原酸应用开发研究进展[J].江苏调味副食品，2020（2）：1-3.

[3]万凡，侯扶江，伊宝，等.绿原酸的生理功能及其在畜禽生产中的应用[J].动物营养学报，2021（5）：2416-2427.

[4]白盼盼，张晨，徐美利，等.绿原酸类化合物的生物活性及其在畜牧生产中的应用[J].饲料研究，2022，45（6）：127-130.

[5]李卓妮，刘峰，孔艳华，等.杜仲叶对鸡增重、生化指标及肉品质的影响[J].动物医学进展，2022，43（1）：85-89.

[6]宋金秋，燕丽娜，李晖，等.杜仲叶水提物对湘西土鸡生长发育及免疫功能的影响[J].中国饲料，2021（24）：29-32.

[7]孙阳，黄和，胡燚.绿原酸提取纯化方法的研究进展[J].化学试剂，2017（3）：257-262.

[8]未俊峰，高伟，程远新，等.近红外光谱技术快速检测甜叶菊中绿原酸含量[J].食品与发酵工业，2023（16）：298-304.

[9]李冉，齐芪，李赟，等.HPLC-MS/MS检测杜仲中绿原酸等4种活性成分的分析方法[J].北京林业大学学报，2016（6）：123-129.

[10]韓竹，基于碳点为探针的利福平、绿原酸、Cu2+和谷胱甘肽的荧光检测新方法研究[D].重庆：西南大学，2020.

【作者简介】

杨慧杰，女，1986年出生，高级畜牧师，硕士，研究方向为饲料、畜产品检验检测及相关标准制修订。

（编辑：李钰双）