超高效液相色谱-串联质谱法同时检测牛奶中7种杀虫剂残留

苏葳艺 杨慧杰 徐丽佳

【摘要】本研究以固相萃取技术作为样品前处理方法，通过超高效液相色谱-串联质谱对处理完的样品进行定性、定量检测，建立了同时测定牛奶中辛硫磷、敌敌畏、敌百虫、灭线磷、灭多威、杀线威和乙酰甲胺磷7种杀虫剂残留量的检测方法。结果表明，7种杀虫剂辛硫磷的检出限为2.0μg/L，定量限为5.0μg/L；杀线威的检出限为1.0μg/L，定量限为3.0μg/L；敌敌畏、敌百虫、灭线磷、灭多威和乙酰甲胺磷的检出限为0.5μg/L，定量限为2.0μg/L；在2.0～500.0μg/kg浓度范围内具有良好线性关系，R>0.999，平均回收率为70%～95%（RSD<10%，n=6）。

【关键词】牛奶；杀虫剂；超高效液相色谱-串联质谱法；检测

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.02.001

Simultaneous Determination of 7 Insecticides in Milk by Ultra-High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

SU Weiyi， YANG Huijie， XU Lijia

（Liaoning Inspection，Examination & Certification Centre〔Liaoning Lnstitute forAgro-product Veterinary Drugs and Feed Control〕， Shenyang 110036， China）

Abstract： Study by using solid phase extraction technique as a pretreatment method， a tandem mass spectrometry on processed samples were detected qualitatively and quantitatively by ultra-high performance liquid chromatography analysis method to set up the milk of Phoxim， dichlorvos， trichlorfon， ethoprophos， methomyl， oxamyl and acephate.The detection limit of phoxim is 2.0μg/L， the quantitative limit of g/Lis 5.0μg/L， the detection limit oxamyl is 1.0μg/L， the quantitative limit of g/Lis 3.0μg/L， the detection limit for dichlorvos， trichlorfon， ethoprophos， methomyl， and acephate is 0.5μg/L， the quantitative limit of g/L is 2.0μg/L in the concentration of 2.0～500.0μg/L range and peak area were showed good linear relationship， R>0.999， the average recovery rate of 70%～95% （RSD<10%， n=6）.

Keywords： milk； insecticide； UPLC-MS/MS； detection

殺虫剂污染是影响奶源安全性的因素之一。杀虫剂主要通过以下几种途径残留在牛奶中：一是奶牛食用含有杀虫剂残留的饲料后通过食物链在体内蓄积；二是夏季收购站为防止蚊虫使用杀虫剂，造成奶源污染；三是奶牛养殖过程中，养殖场为了驱除蚊虫喷洒杀虫剂。因污染途径多样，牛奶中可能存在的杀虫剂种类也多样。

本研究以较为常用的辛硫磷、敌敌畏、敌百虫、灭线磷、灭多威、杀线威和乙酰甲胺磷7种杀虫剂为研究对象，采用固相萃取技术、色谱技术和质谱技术，建立一种同时检测牛奶中7种杀虫剂残留的高效液相色谱-串联质谱分析检测方法，为有效保障牛奶的质量安全提供技术支撑。

1试验部分

1.1仪器与试剂

1.1.1仪器设备

高效液相色谱-串联质谱仪（ACQuITY-Quattro Premier XE，美国Waters公司）；分析天平AL104-IC（Max：110 g，e=0.001 g，Min：0.01 g，d=0.0001 g）；HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8μm）；振荡器；离心机（低温高速离心机CF 16RXⅡ）；氮吹仪（N-EVAP 112）；涡旋混合器；固相萃取装置。

1.1.2试剂

乙腈（色谱纯）；甲醇（色谱纯）；正己烷（色谱纯）；乙酸乙酯（色谱纯）；甲酸（色谱纯）；丙酮（高效液相色谱淋洗剂）；无水乙醚（分析纯）；无水硫酸镁（分析纯）；微孔过滤膜（0.2μm）；HLB固相萃取柱（6 cc/200 mg）；C18固相萃取柱（6 cc/500 mg）；FLORISIL固相萃取柱（6 mL/500 mg）；PSA固相萃取柱（6 mL/500 mg）；Alumina-N固相萃取柱（6 mL/2 g）。

1.1.3标准品

敌敌畏标准品（100μg/mL，1.2 mL丙酮溶剂）；敌百虫标准品（100μg/mL，1.2 mL丙酮溶剂）；辛硫磷标准品（100μg/mL，1.2 mL甲醇溶剂）；灭线磷标准品（100μg/mL，1.2 mL丙酮溶剂）；灭多威标准品（100μg/mL，1.2 mL丙酮溶剂）；杀线威标准品（100μg/mL，1.2 mL甲醇溶剂）；乙酰甲胺磷标准品（100μg/mL，1.2 mL丙酮溶剂）。

1.2溶液配制

单个标准溶液的制备：分别准确移取500μL敌敌畏、敌百虫、辛硫磷、灭线磷、灭多威、杀线威、乙酰甲胺磷对照品、氯氰菊酯标准品、溴氰菊酯标准品和氰戊菊酯标准品对照品于50 mL容量瓶中，加入0.2%甲酸水溶液定容至刻度，混匀后制成浓度为100μg/L的对照品工作液，放置于2～8℃避光存放。

混合标准溶液的制备：准确移取500μL敌敌畏、敌百虫、辛硫磷、灭线磷、灭多威、杀线威、乙酰甲胺磷、氯氰菊酯标准品、溴氰菊酯标准品和氰戊菊酯标准品对照品于50 mL容量瓶中，用0.2%甲酸水溶液定容，配制成浓度100μg/L的工作液，放置于2～8℃避光存放。

1.3仪器工作条件

1.3.1色谱条件

HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm）。流速：0.3 mL/min。进样量：10μL；流动相：A相（0.2%甲酸水溶液），B相（甲醇）。洗脱条件：0～1 min，95%A∶5%B；1～1.5 min，从95%A∶5%B线性变化至60%A∶40%B；1.5～2.5 min，从60%A∶40%B线性变化至30%A∶70%B；2.5～3.5 min，从30%A∶70%B线性变化至10%A∶90%B；3.5～4 min，保持10%A∶90%B；4～4.1 min，从10%A∶90%B线性变化至95%A∶5%B；4.1～6 min，维持95%A∶5%B。

1.3.2质谱条件

离子源：电喷雾离子源；电离方式：正离子（ESI+）；锥孔气流速：50 L/h；检测方式：多反应监测（MRM）；源温：120℃；毛细管电压：2.5 kV；雾化气流速：650 L/h；雾化温度：350℃。其他质谱参数见表1。

1.4前處理方法

准确量取5 mL试样于50 mL离心管内，加入10 mL乙腈，震荡5 min，超声10 min。以7000 r/min高速离心10 min。静置30 s后取5 mL上清于10 mL离心管中，40℃氮气吹干，用1.5 mL甲醇和2 mL水溶解备用。依次向HLB固相萃取柱中加入3 mL甲醇和3 mL水进行活化，将氮吹复溶后的样品全部加入活化完毕的HLB固相萃取小柱中，过柱完毕后用6 mL水溶液、6 mL甲醇水（2∶3）进行淋洗，最后用6 mL甲醇溶液洗脱。洗脱后用40℃氮气吹干，吹干后用0.2 %甲酸水：甲醇（1∶1）溶液1 mL复溶，过微孔滤膜后上机检测。

2结果与分析

2.1样品提取条件的优化

在样品提取条件的选择上本研究设计了两种方案：方案一为采用纯乙腈作为提取溶剂，取5 mL样品加入10 mL乙腈和5 g硫酸镁震荡超声后，在4℃下以7000 r/min离心10 min，静置分层取5 mL上清，氮吹干待过固相萃取小柱；方案二为采用甲醇-乙酸乙酯（1∶1）溶液作为提取溶剂，取5 mL样品加入10 mL甲醇-乙酸乙酯（1∶1）震荡超声后，以7000 r/min离心10 min，静置分层后去5 mL上清液，氮吹干待过固相萃取小柱。对7种杀虫剂进行添加回收率测定，测定结果显示方案一回收率高，而方案二回收率只有20%～30%，因此采用乙腈作为提取试剂。

2.2样品净化条件的优化

本研究共选用五种固相萃取小柱形成了五种净化方案：方案一采用C18固相萃取柱，用3 mL甲醇、3 mL水进行活化小柱，然后将氮吹后的样品用3 mL的50%甲醇水溶解过柱，3 mL 50%甲醇水淋洗，最后用6 mL 95%的氨化甲醇进行洗脱；方案二采用Alumina-N（中性氧化铝）固相萃取柱，小柱用4 mL正己烷-乙酸乙酯（95∶5）进行活化，然后将氮吹后的样品用3 mL丙酮-乙醚（2∶8）进行溶解过柱，最后用6 mL正己烷-乙酸乙酯（95∶5）洗脱收集；方案三采用FLORISIL（佛罗里硅土）固相萃取柱，小柱用4 mL正己烷-乙酸乙酯（95∶5）进行活化，然后将氮吹后的样品用3 mL正己烷-乙酸乙酯（95∶5）进行溶解过柱，直接收集过柱液；方案四采用PSA（N-丙基乙二胺）固相萃取柱，小柱用4 mL丙酮进行活化，然后将氮吹后的样品用3 mL丙酮进行溶解过柱，直接收集过柱液；方案五采用HLB固相萃取柱，用3 mL甲醇、3 mL水进行活化小柱，然后将氮吹后的样品用1.5 mL的甲醇、2 mL水溶解过柱，3 mL水、3 mL甲醇水（2∶3）淋洗，最后用6 mL的甲醇进行洗脱。

上机结果显示，方案一、二、三不能将各种杀虫剂很好地分离提取出来，只能分离提取出部分杀虫剂，因此弃用。将方案四和方案五处理后的样品上机结果对比得出方案五的杀虫剂图谱相应峰面积更大，响应更强，因此选用HLB小柱作为最终前处理小柱。

2.3质谱方法优化

将各个单独配置好的100μg/L标准品工作液按照10μL/min的速度分别注入质谱中，采用全扫描模式，进行一级质谱扫描，得到辛硫磷母离子；再进行二级质谱扫描，得到辛硫磷母离子对应的碎片离子，取丰度较高的2个子离子，其中1个作为定量离子，另外1个作为定性离子；根据选择的定量离子和定性离子进行碰撞能量的优化，使定量离子的响应达到最佳，即建立了辛硫磷MRM方法；同法建立找出敌敌畏、敌百虫、灭线磷、灭多威、杀线威和乙酰甲胺磷的定性定量离子及其对应的条件。

2.4标准曲线、检出限和定量限

7种杀虫剂中辛硫磷的检出限为2.0μg/L，定量限为5.0μg/L；杀线威的检出限为1.0μg/L，定量限为3.0μg/L；敌敌畏、敌百虫、灭线磷、灭多威和乙酰甲胺磷的检出限为0.5μg/L，定量限为2.0μg/L。浓度范围在2.0～500μg/L时，线性良好，相关系数在0.999以上，具体见表2。

2.5添加回收

7种杀虫剂在5.0μg/L、20.0μg/L和80μg/L浓度添加下回收率在70%～95%，且RSD低于10%，具体见表3。

3结束语

本研究建立了应用超高效液相色谱-串联质谱法同时测定牛奶中辛硫磷、敌敌畏、敌百虫、灭线磷、灭多威、杀线威和乙酰甲胺磷7种杀虫剂残留量的检测方法。与其他检测杀虫剂的方法相比，该方法创新采用HLB固相萃取小柱作为前处理净化方法，更便于牛奶样品的分离、纯化和浓缩。该方法的高通量及较低的检出限、定量限等优势也为保障牛奶的质量安全提供了技术支撑。

【参考文献】

[1]洪华，阚晓丽，张茜，等.QuEChERS-HPLC法同时快速检测水溶肥中10种常见违禁添加杀虫剂[J].安徽农业科学，2021，49（18）：191-194.

[2]潘瑛洁，孟祥河，钱园凤，等.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定茶鲜叶中79种农药残留[J].茶叶科学，2023，43（2）：250-262.

【作者简介】

苏葳艺，男，1987年出生，兽医师，硕士，研究方向为生鲜乳检测方法及相关标准制修订，水产品检测方法研发及推广应用。

（编辑：李钰双）