膝关节骨关节炎动物模型评价方法的研究进展

谌星 刘光年 熊华章 董立明

膝关节骨关节炎（KOA）是常见的慢性关节疾病之一，以疼痛、肿胀和功能障碍等为主要临床表现，且随病情加重可最终导致肢体残疾[1-2]。KOA 发病机制复杂，理想的动物模型是研究KOA发病机制及其治疗手段的重要方法，而建立合适的评价方法是进行动物模型研究的前提[3]。本文对近年KOA 动物模型的评价方法进行综述，并针对不同评价方法的特点进行介绍，为构建理想的KOA 动物模型提供参考。

1 动物及造模方式选择

KOA 造模可选用小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、羊、马和猴等多种动物，这些动物可根据体型大小分为小型、中型及大型动物[4-5]。KOA 动物模型造模方式多样，可分为自发型、手术诱导型和非手术诱导型[4,6-7]。实验目的、实验条件和伦理要求是选择合适的动物模型的主要依据。

2 评价方法

2.1 组织病理学评价

2.1.1 大体观察

有研究提出，在对动物进行安乐死处理后，可沿髌韧带内侧纵行切开皮肤、皮下及关节囊，再外翻髌骨并显露膝关节，从而可以观察软骨的光滑度、颜色及骨赘是否形成[8]。Pelletier 等[9]根据软骨受损程度制定了大体软骨评分系统，评分为0～4分，评分越高提示软骨受损程度越大。Liu 等[10]通过大体观察，发现兔KOA 模型关节软骨表面粗糙，软骨下骨外露，骨赘形成，平均Pelletier 评分为3.9分。大体观察虽然可以直观地看到KOA 动物的典型病变，但对细微病变的研究存在不足。

2.1.2 组织染色

组织学检查虽为有创检查，但目前仍是评价KOA 动物模型的金标准，常作为建模成功的依据[5]。KOA 动物模型评价常用的组织学染色方法包括苏木精-伊红染色、番红固绿染色、Masson 染色、甲苯胺蓝染色、抗酒石酸酸性磷酸酶染色和阿利新蓝染色等。于冬冬等[11]通过苏木精-伊红染色、阿利新蓝染色及Masson 染色发现，大鼠KOA 模型软骨表面粗糙不平、层次紊乱，软骨细胞数量减少，胶原分布广而不均且含量减少，潮线模糊。肖壮等[12]通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色、甲苯胺蓝染色及番红固绿染色发现，大鼠KOA 模型软骨下骨破骨细胞数量早期增加，后逐渐下降至消失，而软骨细胞数量逐渐减少，且染色程度逐渐下降至消失，软管下骨血管侵入潮线。

在组织染色基础上，Mankin 软骨评分系统、O'Driscoll 软骨评分系统、国际骨关节炎研究学会（OARSI）软骨评分系统、国际软骨修复学会（ICRS）软骨评分系统、ICRS Ⅱ软骨评分系统以及改良O'Driscoll 软骨评分系统等相继建立。Bonasia 等[13]对10 种组织染色软骨评分系统进行比较，发现每种评分系统各有优缺点，但ICRS Ⅱ软骨评分系统、O'Driscoll 软骨评分系统和改良O'Driscoll 软骨评分系统可靠性更高。组织染色结合软骨评分系统可在细胞及组织层面对KOA 病变进行评价，为目前最常用的评价方式，但其不足在于必须通过有创的方法获得病理切片，不利于后续实验进行。

2.2 影像学评价

2.2.1 X 线

X 线检查是诊断人KOA 的首选方法，可显示关节间隙变窄、软骨下骨硬化、骨赘及骨囊肿形成等KOA 典型病理变化，其临床应用广泛。Kellgren-Lawrence 分级系统即在X 线检查基础上建立，可用于诊断KOA 和选择治疗方案[14]。Ma 等[15]通过X 线检查发现，兔KOA 模型患肢膝关节表面粗糙不平，关节间隙变小，骨赘形成。X 线检查评估KOA 动物模型易实施，但也存在不足，如有电离辐射，不能观察到细微病变及对软组织敏感度低等。

2.2.2 电子计算机断层扫描

电子计算机断层扫描（CT）可先通过非侵入的方式扫描捕获一系列2D 平面图像，再应用3D重建技术和软件分析系统进行分析，用于评估KOA 动物模型的骨特征。其中micro-CT 可提供高分辨率图像，可对骨小梁结构实现定量分析，被认为是骨结构分析的“金标准”[16]。Radakovich 等[17]通过micro-CT 检查发现，豚鼠KOA 模型患肢髌骨、股骨及胫骨均有骨赘形成，且有软骨下骨硬化和骨囊肿形成。Ketola 等[16]通过micro-CT 检查发现，兔KOA 模型患膝骨体积分数下降，小梁变薄、数量减少、分离增加，软骨下骨板增厚。此外，CT检查结合造影技术可对KOA 动物模型的软骨体积和厚度、血管平均直径和容积进行观察。CT 检查密度分辨率高，可发现骨结构的细微病变，但存在成像时间长，辐射损伤，动物需要麻醉及短时间内不能重复等不足[18]。

2.2.3 磁共振成像

磁共振成像（MRI）检查对组织的分辨率高，已广泛用于疾病的临床诊断。在KOA 动物模型中，MRI 检查可显示软骨、半月板、韧带和滑膜等组织病变，并可对骨结构及软骨组成物质进行量化分析。Sifre 等[19]研究发现，兔KOA 模型软骨及骨的MRI 表现与组织病理学变化有极好的相关性。MRI 检查不需要通过电离辐射便可生成组织间的对比图像，无辐射危害，但其不足在于扫描时间长，对微小骨折及钙化灶缺乏敏感性，使用成本高等。

2.2.4 超声

超声检查可显示关节内软组织情况，可用于评估KOA 动物模型的滑膜炎症、关节积液和软骨及半月板损伤等病变。罗春海等[20]通过超声检查发现，狗KOA 模型患肢关节腔积液增多，滑膜增厚，关节腔面毛糙不平，膝关节内外髁软骨厚度变薄。Xu 等[21]通过超声检查发现，小鼠KOA 模型患肢膝关节空间体积、滑膜炎症面积百分比和血流量均增加，结果与OARSI 评分密切相关。超声检查对软组织成像清晰，采集时间短，操作方便，无电离辐射，但不能显示骨组织为其最大不足。

2.2.5 分子影像技术

分子影像技术是将影像技术与分子生物技术相结合而形成的新型技术，涵盖多个学科内容，可在细胞及分子水平检测生物体内的病理变化，以用于疾病发展机制及药物疗效等方面的研究[22]。除CT、MRI 和超声等传统影像技术外，现有分子影像技术有正电子发射成像、单光子发射计算机断层成像、生物发光成像、荧光成像、光声成像及光学层析成像等[23-24]。目前，分子影像技术已用于检测KOA 动物模型中的胶原蛋白、糖胺聚糖及基质金属蛋白酶等多种分子物质的动态变化及骨代谢活性，可用于KOA 早期诊断[25-27]。与传统病理及影像技术相比，分子影像技术可从分子水平发现异常，从而在疾病尚未形成解剖及组织改变时早期发现病变。此外，分子影像技术还可对KOA动物模型病变进行动态、可持续且无创的监测，但其存在对设备要求高、费用昂贵等不足。

2.3 症状评价

KOA 的主要临床表现包括疼痛及功能障碍。动物模型KOA 发生发展时，动物也会出现相应症状。因此，评估动物的症状可以评价建模效果。

疼痛和功能障碍的评估方法包括静态和动态评估两类：①静态评估，是指对诱发疼痛的评估，常见方法包括Vonfrey 试验、哈格里夫斯试验、冷敏感实验及膝关节伸展实验等。②动态评估，是指观察及记录动物的活动，根据活动情况评估动物的疼痛及功能障碍程度。常见方法包括自发活动检测、运动分析、爪印评估、步态分析及转轮跑步运动等[28-30]。Zhang 等[31]通过Vonfrey 试验和温度可调平板系统发现，大鼠KOA 模型对机械刺激、冷刺激和热刺激均表现敏感。Alsalem 等[32]通过Vonfrey试验、静态承重仪器和活动检测系统发现，大鼠KOA 模型机械缩足反射阈值下降，患肢负重及活动量减少。Williams 等[33]通过Vonfrey 试验、哈格里夫斯试验、步态分析和静态肢体负重实验发现，大鼠KOA 模型出现视觉可见的跛行，机械缩足反射阈值下降，热刺激敏感，站立期减少，摆动期增加，静态承重不对称。此外，采用根据疼痛反应、步态、关节活动范围及肿胀程度所制定的改良Lequesne MG 量表对KOA 动物模型进行症状评价后发现，评分高低与KOA 严重程度相关[34]。症状评价可以通过症状的严重程度判定KOA 动物模型的病变程度，但并不能因此确定KOA 动物模型是否建模成功。

2.4 关节镜评价

关节镜检查系采用微创方法发现关节腔内软骨、半月板、韧带和滑膜病变，在临床上应用广泛，也可用于KOA 动物模型评价。Bi 等[35]通过关节镜检查发现，恒河猴KOA 模型患肢股骨内侧髁软骨会出现不同程度的磨损缺失。Flynn 等[36]通过关节镜检查发现，羊KOA 模型患肢会出现不同程度的胫骨平台和股骨髁软骨损伤，伴滑膜肿胀。关节镜检查可在活体上对关节内病变持续监测，但因设备及操作要求，仅适用于关节腔较大的动物。

2.5 生物标志物评价

KOA 病变过程中，软骨、骨及滑膜组织的多种生物标志物会出现变化。这些物质包括炎症因子、软骨细胞及细胞外基质的代谢前体和产物等，存在于尿液、血液、关节液及软骨组织中，可采用聚合酶链反应、蛋白质免疫印迹、免疫组织化学等方法进行检测[5,37-38]。但在KOA 动物模型构建中，大部分生物标志物缺乏特异性，因而不能根据生物标志物变化确定KOA 动物模型是否建模成功。

3 结语

KOA 动物模型有多种评价方法，包括组织病理学评价、影像学评价、症状评价、关节镜评价及生物标志物评价。组织病理学评价通过大体观察和多种组织染色方法可以显示软骨退变、滑膜炎症及骨赘形成等病理变化，并有多种软骨评分系统，适用于所有动物模型，是应用最广泛的动物KOA 模型评价方法，尚无任何替代方法，但其不足在于需要处死动物后才能获取标本，若未能成功建立模型则需要重新建模。X 线、CT、MRI 和超声等影像技术可通过无创方式对KOA 动物模型进行评价，适用范围广，具有可重复性，可动态观察KOA 动物模型的病变过程，直至建立模型为止，可避免组织病理学评价可能反复建模的风险，而其缺点在于MRI 和CT 检查费用昂贵，随着动物模型专用检查设备的改进和使用，检查费用和反复造模的成本已大大降低。症状评价通过发现KOA所引起的疼痛、功能及行为改变，推断KOA 的严重程度，多用于大鼠、小鼠等小型动物，但部分症状判断存在主观性，故仅作为KOA 动物模型的辅助评价方法。关节镜评价没有普适性，生物标志物评价缺乏特异性，故都只作为KOA 动物模型的辅助评价方法。

目前，无创且简化的方法是动物模型评价方法的发展趋势[39]。高分辨率的CT 及MRI 检查可成为无创评价的方向，但其步骤需要进一步简化并标准化。此外，随着影像技术及分子技术的发展，高特异性的分子探针及高分辨的图像获取及分析技术的产生，分子影像技术应用前景巨大。