酸处理?酶制剂对杏鲍菇菌渣还原糖和纤维素降解的影响

王岩　于洪敏　李娟　刘艳　江国托

摘要 为探究酸处理（酸浓度、时间、温度）、酶制剂（纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶）对杏鲍菇菌渣的影响，以河北采集的杏鲍菇菌渣为原料，以总还原糖含量为研究指标，通过主成分分析方法研究影响杏鲍菇菌渣酸处理的因素；以中性洗涤纤维减少量和酸性洗涤纤维减少量为响应值，开展正交试验，分析酶制剂对其的影响。结果表明：40 ℃条件下，2%和3%酸浓度处理随时间的延长会降解总还原糖；60 ℃条件下，酸浓度的增加可以减缓总还原糖的降解；80 ℃条件下，1%和2%酸浓度处理可以促进多糖的降解，提高总还原糖含量。根据主成分分析结果可知，温度与总还原糖含量呈正相关，是影响杏鲍菇菌渣多糖降解的最主要因素。正交试验结果表明，木聚糖酶添加量和纤维素酶添加量是影响中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维降解的最主要因素，最优酶解配方为纤维素酶85 U/mL、木聚糖酶220 U/mL、葡聚糖酶40 U/mL，说明菌渣经酸、酶处理后可作为反刍饲料。

关键词 杏鲍菇菌渣；酸处理；酶制剂；还原糖；纤维素

中图分类号 S548 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2024）08-0086-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.08.020

Effects of Acid Treatment and Enzymatic Hydrolysis on Reducing Sugar and Cellulose Degradation of Pleurotus eryngii Residue

WANG Yan，YU Hong-min，LI Juan et al

（Dalian Sanyi Animal Medicine Co.，Ltd.，Dalian，Liaoning 116036）

Abstract In order to explore the effects of acid treatment （acid concentration，time and temperature），enzyme preparations （cellulase，xylanase，β-glucanase） on Pleurotus eryngii fungus residue.The experiment used the mushroom residue of Pleurotus eryngii collected in Hebei Province as the raw material，total reducing sugar content as the research index，the factors affecting the acid treatment of P.eryngii residue were analyzed by principal component analysis.At the same time，the effects of enzyme preparation on the reduction of neutral detergent cellulose and acid detergent cellulose were analyzed by orthogonal test.At 40 °C，2% and 3% acid concentrations would degrade the content of reducing sugar with time.At 60 °C，the increase of acid concentration could slow down the degradation of total  reducing sugar.At 80 ℃，1% and 2% acid concentrations could promote the degradation of polysaccharides and increase the content of total reducing sugar.According to the principal component analysis，temperature was the most important factor affecting the content of reducing sugar of P.eryngii slag.The orthogonal test results showed that the degradation of  xylanase and cellulase were the main factors affecting the reduced amount of neutral detergent cellulose and acid detergent cellulose respectively.The optimal enzymolysis formula was cellulase 85 U/mL，xylanase 220 U/mL and glucanase 40 U/mL.These results indicated that the bacterial residue after acid and enzyme treatment has nutritional value as a ruminant feed.

Key words Pleurotus eryngii residue;Acid treatment;Enzyme preparation;Reducing sugar;Cellulose

食用菌在收获后的培养基质称为菌渣，由于食用菌的栽培大多以木屑、玉米芯、秸秆、棉籽壳、甘蔗渣等为培养基质，因此含有大量的真菌菌丝体蛋白、半纤维素、纤维素、木质素以及氮、磷、钾、维生素等以及蘑菇分泌的用于降解底物的胞外水解酶、氧化酶，是潜在的反刍饲料来源［1］。菌渣的生产速度远远超过现有的应用需求，预计到2026年全世界产量将达到2 084万t［2］。作为一種木质纤维素材料，菌渣可作为生产生物燃料和其他生物材料的还原糖来源，但要通过预处理去除木质素和半纤维素并破坏纤维素的晶体结构，以克服菌渣中粗纤维、木质素等成分很难被动物直接利用的问题［3-4］，从而实现纤维素的有效转化。

菌渣处理可分为传统的溶剂提取方法和绿色高效的物理提取方法。其中，溶剂提取方法有碱水解和酸水解，物理提取方法有酶水解、热水解和超声提取。酸水解和热水解一般结合使用，破坏纤维素的致密结构，降低结晶性［5］和聚合度，将纤维素分解成葡萄糖，将半纤维素分解为木糖等可溶性糖类［6-7］。目前研究较多的是高温水解［8-9］，低温水解相关研究较少。低温（小于100 ℃）对设备要求较低，操作安全，节约成本。Wu等［8］研究表明酸水解获得的还原糖产量高于碱水解与酶制剂处理，酸处理可作为

将菌渣中的木质纤维素转化为糖的一种经济、高效方法。酶制剂处理条件温和，可以降低纤维素的含量。目前低温（小于100 ℃）酸处理对杏鲍菇菌渣的影响程度尚不清楚，纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶对菌渣纤维素的降解程度研究较少，因此通过酸浓度、时间和温度3个方面，以总还原糖含量为研究指标，通过主成分分析探究影响杏鲍菇菌渣酸处理的主要因素；以中性洗涤纤维减少量和酸性洗涤纤维减少量为研究指标，通过正交试验探究酶制剂对杏鲍菇菌渣纤维素的降解情况，以期为促进食用菌菌渣的循环利用、增加反刍动物饲料原料来源提供科学依据，为蘑菇工业副产品的综合利用及利用水解产物残渣生产生物肥料提供一条重要途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 杏鲍菇菌渣。

杏鲍菇菌渣采集于河北省廊坊市，采收后3 d内寄到大连三仪动物药品有限公司实验室。收到菌渣后，立即切成约1 cm×1 cm大小，置于电热鼓风干燥箱中30 ℃烘干，使用多功能粉碎机粉碎后，过60目筛备用。

1.1.2 主要试剂。

硫酸（丹东市龙海试剂厂）；3，5-二硝基水杨酸（天津市大茂化学试剂厂）；氢氧化钠（天津市科密欧化学试剂有限公司）；酒石酸钾钠（天津市科密欧化学试剂有限公司）；无水亚硫酸钠（天津市科密歐化学试剂有限公司）；无水葡萄糖（天津市科密欧化学试剂有限公司）等；纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶均由江苏三仪科研质量控制中心提供。

1.2 主要仪器

高速多功能粉碎机（型号CS-700，永康市天祺盛世工贸有限公司）、电热鼓风干燥箱（型号DHG-9240A，上海一恒科学仪器有限公司）、分析天平（型号FA2004，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、全自动凯氏定氮仪（型号K1100，山东海能科学仪器有限公司）、紫外可见分光光度计（型号TU-1810，北京普析通用仪器有限责任公司）、离心机（型号TDZ5-WS，长沙湘智离心机仪器有限公司）等。

1.3 试验方法

1.3.1 试验设计。

1.3.1.1 菌渣基本成分。试验前对菌渣基本成分进行检测。

1.3.1.2 酸处理菌渣。

根据文献［10］方法，结合生产工艺的可操作性，取粉碎后的干燥菌渣10 g置于250 mL烧杯中，分别加入1%、2%和3%硫酸10 mL，搅拌均匀后置于40 ℃电热鼓风干燥箱中反应。1、2、3 h时每个酸浓度各取2份，5 000 r/min 离心10 min取上清，测定总还原糖含量。按照相同方法进行60和80 ℃不同浓度酸处理。

1.3.1.3 酶制剂处理菌渣。

根据预试验的酶制剂添加量，选择纤维素酶添加量（45、65、85 U/mL）、木聚糖酶添加量（180、200、220 U/mL）和β-葡聚糖酶添加量（40、60、80 U/mL）进行3因素3水平正交试验。取9个100 mL三角瓶，分别加入5 g 经处理的干燥菌棒粉，加入15 mL水，酶制剂按照正交表添加量依次加入，盖上瓶塞后，于100 r/min、50 ℃的摇床中振荡水解。试验24 h时，试样按照张安荣［11］的方法处理，处理后测定中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量。

1.3.2 测定指标与方法。

菌渣的成分鉴定采用国标方法，具体如下：水分含量GB/T 6435—2014，粗脂肪含量GB/T 6433—2006，粗蛋白含量GB/T 6432—2018，中性洗涤纤维含量GB/T 20806—2006，酸性洗涤纤维含量NY/T 1459—2007，木质素含量GB/T 20805—2006，钙含量GB/T 6436—2018，磷含量GB/T 6437—2018。

总还原糖含量检测参照张美江［12］的二硝基水杨酸法，杏鲍菇菌渣中含有大量的酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维以及木质素。二硝基水杨酸法是在碱性条件下与总还原糖发生氧化还原反应，产物煮沸后在540 nm下有吸收，故通过比色法测定总还原糖含量。

分别取1 mg/mL葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 置于15 mL试管，用去离子水补足1.0 mL；分别加入DNS试剂2.0 mL，沸水浴加热5 min，流水冷却，用去离子水定容至15.0 mL，在540 nm波长下测定吸光度，绘制葡萄糖标准曲线。以吸光度为横坐标，以葡萄糖浓度为纵坐标，标准曲线方程为Y=0.064 6X+0.006 3（R2=0.999）。样品检测方法：将酸解液样品适当稀释，使糖浓度为0.1～1.0 mg/mL；取稀释后的样品溶液1.0 mL 置于15 mL试管中，加入DNS 试剂2.0 mL，沸水煮沸5 min，冷却后用去离子水补足15.0 mL，在540 nm 波长下测定吸光度。根据葡萄糖浓度的标准曲线，计算出样品总还原糖含量。

1.3.3 数据统计与分析。

应用SPSS 21.0统计软件对试验数据进行统计分析，数据间的比较采用Duncan模型进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著，同时使用该软件中皮尔逊相关系数确定各因素间相关性；应用XLSTAT软件对各影响因素进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚类分析。使用SPSS 21.0统计软件进行正交试验设计及方差分析，使用Excel软件进行数据计算。

2 结果与分析

2.1 营养成分分析

对河北地区收集的杏鲍菇菌渣进行营养成分分析，结果显示：水分含量49.93%，粗蛋白含量8.57%，粗脂肪含量2.48%，钙和磷含量共0.77%，中性洗涤纤维含量66.09%，酸性洗涤纤维含量45.01%，木质素含量9.26%。含量较高的营养成分为粗蛋白、纤维素和木质素，其中钙和磷含量基本满足奶牛的需要量［12］。该试验测得的营养成分含量在宫福臣［13］调研的食用菌菌渣营养成分范围内，具有一定的指导意义。

2.2 酸处理对杏鲍菇菌渣总还原糖含量的影响

2.2.1 不同温度下总还原糖含量在不同酸浓度下随时间的变化。

40 ℃下总还原糖含量在不同酸浓度下随时间的变化如表1所示。由表1可知，40 ℃下，1%酸浓度处理杏鲍菇菌渣在不同时间点总还原糖含量无显著差异；2%和3%酸浓度时，同一酸浓度下杏鲍菇菌渣总还原糖含量随时间的延长呈现下降趋势，1 h时总还原糖含量最高，分别为6.24和6.44 mg/mL。这表明40 ℃条件下1%酸浓度处理杏鲍菇菌渣的总还原糖含量受时间的影响不显著，2%和3%酸浓度处理后杏鲍菇菌渣中的总还原糖随时间的延长发生降解［13］。同一时间点，1 h时总还原糖含量随酸浓度的提高而升高，1 h时3%酸浓度处理总还原糖含量最高，为6.44 mg/mL；2和3 h 时，总还原糖含量随酸浓度的提高而降低。

60 ℃下杏鲍菇菌渣总还原糖含量在不同酸浓度下随时间的变化如表2所示。由表2可知，同一酸浓度下，总还原糖含量随时间的延长呈先增加后下降的趋势，2 h时总还原糖含量最高，1%、2%、3%酸浓度处理分别为7.81、11.14和9.52 mg/mL。60 ℃下，与2 h时相比，酸处理3 h时总还原糖发生了降解，其中1%酸浓度下总还原糖降解率最多，为5.89%；其次是2%和3%酸浓度，分别为5.39%和4.41%，表明60 ℃下酸浓度的增加可以减缓总还原糖的降解。同一时间点，1 h时总还原糖含量随着酸浓度的升高而升高，最高值为8.74 mg/mL；2 h和3 h时，总还原糖含量随着酸浓度的增加呈先上升后下降的趋势，2%酸浓度处理总还原糖含量较高，分别为11.14和10.54 mg/mL。

80 ℃下杏鲍菇菌渣总还原糖含量在不同酸浓度下随时间的变化如表3所示。由表3可知，同一酸浓度下总还原糖含量的变化趋势存在差异。1%酸浓度处理杏鲍菇菌渣的总还原糖含量随时间的延长而升高；2%酸浓度处理后的总还原糖含量随着时间的变化而逐渐升高，3 h时总还原糖含量最高，为20.49 mg/mL；3%酸浓度处理后的总还原糖含量随着时间的变化而先升高后下降，3%酸浓度处理3 h时总还原糖发生降解，2 h 时总还原糖含量最高，为17.51 mg/mL。这表明当温度升高到80 ℃时，1%酸浓度处理促使多糖降解速率减缓，2%酸浓度处理可以促进多糖的降解，提高总还原糖的含量，而3%酸浓度处理3 h时总还原糖发生降解。同一时间点，总还原糖含量均随着酸浓度的升高而先升高后降低，2 h时1%、2%、3%酸浓度处理的总还原糖含量最高，分别为17.19、18.59和17.51 mg/mL；3 h时，80 ℃时各个酸浓度处理后的总还原糖均发生降解，2 h可以实现有效的预处理。

2.2.2 酸浓度、时间、温度和总还原糖含量的主成分分析。

通过分析以上结果发现，酸浓度、时间和温度不同条件下均对总还原糖含量有影响。为了分析3个因素对总还原糖含量的影响程度，对酸浓度、时间、温度和总还原糖含量进行主成分分析。主成分分析是将原坐标轴旋转为相互正交的坐标轴，根据贡献率大小选择主成分，贡献率越大，解释指标能力越强；几个主成分的贡献率之和（累计贡献率）越大，越能全面解释原数据，主成分个数的选择根据累计贡献率而定［14］。变量的余弦平方值反映变量在不同主成分上的相关性程度，最大值所在的主成分与该变量的相关性最强。不同主成分之间无相关性，同一主成分的变量间存在正相关和负相关关系［15］。树状图聚类分析是通过计算样品间的聚类统计量（距离 、相关系数等）将相关性最大的样品聚在一起［16］。

根据以上数据，对其進行主成分分析，如图1所示。变量的余弦平方值如表4所示。对不同酸浓度、时间和温度处理的杏鲍菇菌渣总还原糖含量进行树状图聚类分析，如图2所示。树状图聚类结果有利于解释主成分分析中样品的变化趋势。

由图1可知，主成分1贡献率为48.69%，主成分2贡献率为25.00%，累计贡献率为73.69%。结合表4可知，主成分1的变量有总还原糖含量和温度，且都位于主成分1的正方向，表明总还原糖含量与温度呈正相关关系；时间位于主成分2正方向，酸浓度属于主成分3，表明温度对总还原糖含量的影响最大。

由图2可知，不同条件处理的杏鲍菇菌渣总还原糖含量可分为3类，且按照温度聚类，分别为40、60和80 ℃。图1分为3个部分（虚线划分），3个部分沿着主成分1从左向右移动，80 ℃区域位于主成分正方向，表明温度对总还原糖含量的影响起主要作用，总还原糖含量随着温度的升高而增加。

为了分析酸浓度和时间对杏鲍菇菌渣总还原糖含量的影响程度，对80 ℃数据进行相关性分析，结果如表5所示。由表5可知，总还原糖含量与时间显著相关（P<0.05），总还原糖含量与酸浓度未达到显著相关（P>0.05），表明除了温度外时间是影响总还原糖含量的第二主要因素。

2.3 酶制剂对杏鲍菇菌渣纤维素降解的影响

以中性洗涤纤维减少量和酸性洗涤纤维减少量为响应值，进行正交试验，结果如表6所示。由表6可知，中性洗涤纤维减少量和酸性洗涤纤维减少量最大的是第7组，中性洗涤纤维减少量和酸性洗涤纤维减少量分别为23.05%和18.63%，其对应的工艺条件为A3B3C1。从极差R可以看出，3个因素对中性洗涤纤维减少量影响的主次顺序为木聚糖酶添加量＞纤维素酶添加量＞葡聚糖酶添加量，3个因素对酸性洗涤纤维减少量影响的主次顺序为纤维素酶添加量＞木聚糖酶添加量＞葡聚糖酶添加量。同时可以看出，最佳酶制剂添加方案为纤维素酶85 U/mL、木聚糖酶220 U/mL、葡聚糖酶40 U/mL。

由表7～8可知，纤维素酶添加量和木聚糖酶添加量对中性洗涤纤维减少量和酸性洗涤纤维减少量均具有显著影响，而β-葡聚糖酶添加量对其没有显著影响。由此可见，纤维素酶和木聚糖酶是降解杏鲍菇菌渣纤维素的主要酶制剂。

3 讨论

从蘑菇副产品中提取的多糖大致可分为酸性残多糖、碱性残多糖和酶残多糖3类［17］。Qiao等［9］在120 ℃下用6%稀硫酸预处理菌渣120 min后还原糖含量最高为267.57 g/kg。Zhu等［18］为了提高成本效益和避免环境问题，用碱和酸预处理与酶水解相结合的方法处理菌渣，总还原糖含量为230 mg/g，碱处理试验发现温度和氢氧化钾浓度的影响比预处理时间更显著，经石灰预处理的菌渣在低温（50 ℃）下随着时间的延长有释放更多糖的潜力。Zhang等［19］采用热碱提取法将香菇菌渣在90 ℃下提取300 min并进行2次脱盐后的总糖含量为58.1%，显著高于用热水提取的总糖含量（4.76%）和超声波+酶提取的总糖含量（14.39%），原因可能是碱容易破坏多糖与细胞壁或细胞间物质之间的结合，从而促进细胞内多糖的释放。Wu等［8］研究发现用酸提取的还原糖含量高于用氢氧化钠、氢氧化钙和热水提取的还原糖含量。Corrêa等［3］用纤维素酶和β-葡萄糖苷酶酶解菌渣，产生（77.5±4.0）μmol/L的总还原糖。

对于酸处理，不同处理条件下杏鲍菇菌渣总还原糖含量的主要影响因素不同。笔者通过主成分分析发现，影响杏鲍菇菌渣酸处理的主要因素是温度和时间。张美江［12］研究表明总还原糖含量的影响因素依次为温度、酸浓度、时间，酸浓度对预处理的影响不显著，原因首先可能与试验的酸浓度和温度有关。随着温度的升高，提高酸浓度可以促进总还原糖的产生，故高酸浓度处理要对应设置高温度。其次，这还可能与料水比有关，较高的含水量可能会提高酸作用面积，提高其影响程度。黄民凤［20］采用热水浸提法提取金针菇多糖，发现影响提取的因素依次为时间、料液比、温度。结合此试验结果可知，酸改变了温度对还原糖提取的影响。关于酶制剂对菌渣纤维素降解的研究较少。王乐乐等［21］研究表明菌酶协同发酵可以改善菌渣发酵饲料品质。在酶制剂选择上，马冰清等［22］处理香菇菌渣所用的酶制剂为纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶，酶总添加量为660 U/g，3种酶的添加比例为3∶2∶1。张安荣［11］利用纤维素酶、木聚糖酶和β-半乳糖苷酶协同发酵菌渣，中性洗涤纤维降解率为23.69%。此研究中性洗涤纤维的最大降解率达34.88%，其原因一是所用酶制剂不同，二是菌渣具有不同的酶系统，对木质纤维素具有不同的水解效率，因此影响了木质素结构的破坏程度。

4 结论

不同温度下酸浓度及处理时间对杏鲍菇菌渣总还原糖含量的影响不同，不同温度有不同的适宜酸浓度和时间。40 ℃时，适合1%酸浓度，高浓度酸会降解产生的总还原糖；60 ℃时，酸浓度的增加可以减缓总还原糖的降解；80 ℃时，1%和2%酸浓度处理促进多糖的降解，提高总还原糖的含量。根据主成分分析结果可知，该试验条件下温度是影响杏鲍菇菌渣预处理的最主要因素，其次为时间，≤80 ℃条件下预处理菌渣时酸浓度不宜过高。纤维素酶添加量和木聚糖酶添加量对杏鲍菇菌渣纤维素降解的影响显著。综上所述，菌渣酸处理可后不溶性多糖水解成可发酵糖，酶处理可降解纤维素。

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基金项目 2019年大连市青年科技之星项目（2019RQ146）。

作者简介 王岩（1991—），女，辽宁朝阳人，工程师，硕士，从事微生物酶制剂饲料研究。*通信作者，教授，博士，博士生导师，从事分子免疫学与兽医学研究。

收稿日期 2023-04-06；修回日期 2023-06-06