新橙皮苷治疗溃疡性结肠炎的网络药理学研究及实验验证

吴与伦，张欣然，沈阿灵，刘丽雅，魏丽慧，陈友琴，方 翌*

（1.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122；3.福建中医药大学科技创新与转化中心，福建 福州 350122；4.美国凯斯西储大学医学院，俄亥俄州 克利夫兰 44106）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种慢性炎症性肠病，以黏膜和胃肠道生理改变为特征，临床表现为腹痛、便血、腹泻、体质量减轻，但目前其发病机制尚不清楚［1］。UC 的主要病机以湿热瘀血为标，脾肾亏虚为本；清热化湿散瘀、止泻止痢为其治法治则［2］。中医药治疗UC 的历史悠久，临床疗效确切，抗炎效果显著［3］。清化肠饮是临床治疗UC 的常用方，方中厚朴苦燥降泻，辛散温通，入大肠经，是中医学治疗胃肠疾病要药［4］。新橙皮苷作为厚朴中的活性成分，在最新的研究中被证实具有较强的抗炎、抗氧化、免疫调节等作用，可减轻DSS诱导的UC 小鼠结肠黏膜组织病理损伤，但其治疗UC 中的作用机制尚未明确［5-7］。因此，本研究拟采用网络药理学分析和体内实验，初步探讨新橙皮苷治疗溃疡性结肠炎的相关机制，以期阐明新橙皮苷治疗UC 的新机制和新靶点，为临床研发治疗UC 药物提供新的实验依据。

1 实验材料

1.1实验动物 30 只雄性SPF C57BL/6J 小鼠，8～10 周龄，体质量（21±3）g，购自上海SLAC 实验动物科技有限公司，所有动物均饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF 级实验室，动物使用许可证编号：SYXK（闽）2020-0002。本实验已通过福建中医药大学伦理委员会批准（FJTCM IACUC 2022185）。

1.2实验药物的配制 新橙皮苷给药剂量按照人与动物体型系数换算，每只小鼠按照0.1 mL/10 g 的灌胃剂量配制药物，以蒸馏水配置0.5、5、50 mg/（kg·d）的新橙皮苷混悬液，超声4～5 h 至液体充分溶解澄清透明，每日现配现用。

1.3实验试剂 DSS 购自美国MP Biochemicals 公司（货号：0216011080-100 g）；新橙皮苷购自北京MedChemExpress 有限公司，纯度＞98.48%（货号：HY-N0101）；便隐血（OB）试剂（匹拉米洞法）购自珠海市贝索生物技术有限公司（货号：BA2020B）；4%多聚甲醛固定液、苏木素溶液购自北京索莱宝公司（货号：LA0427、G1140）；免疫组化超敏Ultra-SensitiveTMSP 试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司（货号：KIT-9710）；p-p38 一抗购自南京SAB公司（货号：12322）；p38 一抗购自美国CST 公司（货号：8690）。

1.4实验仪器 生物组织脱水机和生物组织石蜡包埋机购自湖北孝感亚光有限公司；全自动石蜡切片机和倒置显微镜购自德国Leica 公司；荧光正置显微镜购自日本Nikon 公司。

2 实验方法

2.1溃疡性结肠炎疾病靶点的收集 以“ ulcerative colitis”为检索词，在GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org/）和DisGenet（http：//www.disgenet.org/）2 个数据库中检索UC 的相关人类基因靶点，并将2 个数据库中的靶点取并集并删除重复项。

2.2新橙皮苷作用靶点预测 在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）、中医药整合药理学研究平台（TCMIP，http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php）、Swisstargets数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、Sym-Map（http：//www.symmap.org/）、BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）中检索新橙皮苷潜在蛋白靶点，利用Unitprot 数据库（http：//www.Unitprot.org/）将获取的蛋白靶点校准其基因名并删除重复项，与UC 的疾病相关靶点取交集获得的新橙皮苷治疗UC 的潜在靶点。

2.3GO 和KEGG 富集分析 将“2.2”项中预测的新橙皮苷治疗UC 的潜在靶点基因名输入DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）中，设置物种为“ homo sapiens”，进行GO 和KEGG 富集分析，筛选P＜0.005的结果，从中选取KEGG 通路富集排名前20和GO 分类富集排名前10 的结果，使用R-Studio 软件对结果进行可视化，并分别绘制相应气泡图。

2.4构建靶点相互作用（PPI）网络 将“2.2”中新橙皮苷治疗UC 的潜在靶点基因名导入STRING 生物信息学数据库（https：//string-db.org/），设置物种为“ homo sapiens”，置信度设定＞0.9，获取作用靶点的互作信息。通过Cytoscape 3.7.2 软件绘制PPI 网络图，并对网络图进行拓扑结构分析，确定新橙皮苷治疗UC 的核心靶点。

2.5小鼠溃疡性结肠炎模型的构建 采用口服2%葡聚糖硫酸钠（DSS）溶液的方法建立溃疡性结肠炎模型［8］，让小鼠自由饮用7 d 2% DSS 溶液，DSS溶液每天更换1 次，第8～10 d 恢复正常饮水，第11 d 取材，期间正常饮食。

2.6分组与干预 小鼠适应性喂养7 d 后，在开始构建模型前，通过随机数字表法将其分为对照组、模型组和低、中、高剂量组，每组6 只。构建模型后，对照组和模型组小鼠使用蒸馏水灌胃，低、中、高组（具体剂量参见“1.2”）使用配置好的不同浓度新橙皮苷溶液灌胃。

2.7疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分及体质量变化计算 造模期间每日通过盲法评估每只小鼠临床特征：包括粪便性状、体质量改变和便血程度情况，并参考JACKSON 等［9］的评估标准计算DAI 评分。同时，每日记录小鼠体质量与给药第1 天变化百分比，绘制小鼠体质量变化百分率折线图［10-11］。

2.8结肠组织免疫组化检测 给药干预11 d 后取材，小鼠结肠组织固定于4%多聚甲醛中；24 h 后，进行组织梯度乙醇脱水及二甲苯石蜡透明，将结肠组织包埋于石蜡，切成4 μm 切片，用显微镜载玻片承载后60 ℃烘烤5 h，将其脱蜡至水化，以0.25%TritonX-100 的PBS 溶液破膜10 min。随后，阻断内源性过氧化物酶活性10 min，并用封闭液阻断抗体非特异性结合1 h。将切片与p-p38 或p38 抗体在4 ℃下孵育过夜，然后与酶标二抗孵育1 h。最后使用二氨基联苯胺（DAB）试剂盒和苏木素对样本进行染色，然后在镜下观察并拍照。

2.9统计学方法 采用SPSS 26.0 统计软件对数据进行分析。计量资料服从正态分布以（±s）表示，多组间体质量变化和免疫组化阳性率比较采用单因素方差分析；不符合正态分布的数据用［M（P25，P75）］表示，多组间DAI 评分比较采用秩和检验进行分析。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结 果

3.1新橙皮苷治疗UC 的潜在作用靶点 由Gene-Cards 数据库和DisGenet 数据库检索获得2 374 个UC 疾病作用靶点，TCMSP、Swiss Target Prediction、TCMIP、SymMap、BATMAN-TCM 数据库检索合计获取101 个新橙皮苷作用靶点。将新橙皮苷潜在蛋白靶点与UC 相关疾病靶点相映射，二者交集获得51 个新橙皮苷治疗UC 的潜在靶点，见图1。

图1 新橙皮苷治疗UC 的潜在靶点

3.2GO 功能富集分析 采用DAVID 数据库对新橙皮苷治疗UC 的潜在靶点进行GO 功能富集分析，获得50 个涉及生物过程（biological process，BP），包括对外源性刺激的反应、胶原分解代谢过程、细胞外基质分解、蛋白水解、基因表达的负调控、环氧合酶途径等，见图2；20 个细胞组分（cellular component，CC），包括细胞外基质、细胞外间隙、大分子复合物、外泌体、细胞质膜等，见图3；42 个分子功能（molecular function，MF），包括内肽酶活性、金属内肽酶活性、丝氨酸内肽酶活性、酶结合、相同蛋白质结合、转录共激活因子结合等。见图4。

图2 新橙皮苷生物过程分析图

图3 新橙皮苷细胞组分分析图

图4 新橙皮苷分子功能分析图

3.3KEGG 通路分析 使用DAVID 数据库对潜在靶点进行KEGG 通路分析，得到66 条通路，根据富集的基因数的多少进行排序，整理出排名前20 名，绘制气泡图。这些交潜在靶点主要富集的通路包括MAPK 信号通路、癌症的发病途径、化学致癌-活性氧、内分泌耐药、雌激素信号通路、糖尿病并发症的AGE-RAGE 通路、IL-17 信号通路等。见图5。

图5 潜在靶点KEGG 信号通路富集分析结果

3.4潜在靶点PPI 网络的构建与分析 STRING 数据库分析新橙皮苷治疗UC 的潜在靶点，构建获取50 个节点，172 条节点连接线的蛋白互作PPI 网络。Cytoscape 3.7.2 软件绘制PPI 网络图，节点平均度值为10.244 897 96，接近中心性平均值为0.515 360 558，介数中心度平均值为0.021 421 335。其中，有19 个节点度值＞平均数，包括：丝裂原激活蛋白激酶14（MAPK14；p38）、白蛋白（ALB）、环状素受体1（ESR1）、纤维连接蛋白1（FN1）、胱天蛋白酶3（CASP3）、环氧合酶2（PTGS2）、成纤维细胞生长因子2（FGF2）、干扰素（IFNG）、前列腺素-内过氧化物合酶2（PTGS2）、胱天蛋白酶1（CASP1）等，以上节点为新橙皮苷治疗UC 的核心靶点。见图6。

图6 新橙皮苷治疗UC 潜在靶点蛋白PPI 互作图

3.5不同剂量新橙皮苷对UC 小鼠体质量的影响 为进一步验证网络药理学的分析结果，本实验采用不同剂量新橙皮苷干预UC 模型小鼠，初步分析新橙皮苷的药效和作用机制。结果表明，与对照组相比，模型组在服用DSS 后体质量出现显著下降（P＜0.05）；然而与模型组相比，低、中、高剂量干预后，体质量都出现显著升高（P＜0.05）。见图7。

图7 新橙皮苷干预对UC 小鼠体质量的影响

3.6不同剂量新橙皮苷对UC 小鼠DAI 评分的影响 5 组小鼠的DAI 评分显示，在第11 天时，对照组的小鼠DAI 评分为0；与对照组相比，模型组在服用DSS 后DAI 评分显著上升（P＜0.05）；与模型组相比，低、中、高剂量新橙皮苷干预都能显著降低DAI 评分（P＜0.05）。见图8。

图8 新橙皮苷干预对UC 小鼠DAI 评分的影响

3.7不同剂量新橙皮苷对UC 小鼠结肠组织中pp38、p38 蛋白的影响 KEGG 富集到的关键通路MAPK 通路中重要组成部分p38（MAPK14）同样在的PPI 蛋白互作网络中富集到，结合图5 和图6 的分析结果，对排分靠前的MAPK 通路关键蛋白pp38 和p38 进行验证分析。结果显示：与对照组比较，模型组小鼠的结肠组织蛋白中p-p38 蛋白的表达水平显著升高（P＜0.05），p38 蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，低、中、高剂量组小鼠结肠组织蛋白p-p38蛋白的表达水平均显著降低（P＜0.05），p38 蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图9—12。

图9 5 组结肠组织p-p38 蛋白阳性面积率比较

图10 5 组结肠组织p-p38 蛋白表达（×400）

图11 5 组结肠组织p38 蛋白表达（×400）

图12 5 组结肠组织p38 蛋白阳性面积率比较

4 讨 论

先前的研究发现，新橙皮苷可通过降低结肠组织中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β 的表达水平来发挥其对UC 的保护作用［5］。本研究通过TCMSP、Swiss Target Prediction、TCMIP、SymMap、BATMANTCM 数据库进行新橙皮苷靶点的挖掘，并通过Dis-Genet 和GeneCards 数据库进行UC 靶点的挖掘，筛选并确定新橙皮苷可能作用于UC的潜在靶点51个。通过KEGG 通路分析，富集到MAPK 信号通路、IL-17 信号通路、化学致癌-活性氧通路等信号通路。MAPK 信号通路的激活主要涉及JNK、ERK 和p38的磷酸化，进一步激活细胞核中的转录信号从而在细胞增殖与分化、凋亡、调节炎症等生理和病理过程中发挥重要作用［12］。林雄［13］发现MAPK通路的激活可以促进NF-κB p65 的磷酸化，上调炎症细胞因子如TNF-α、IL-6 和IL-1β 的表达水平，通过苍术醇提物抑制MAPK 通路的激活可改善UC 症状。IL-17 是一种促炎因子，在多种细胞中都有表达，通过促进TNF-α、IL-6 等炎性因子的释放，发挥扩大炎症等功能［14］。马杰等［15］研究结果表明，黄芩多糖可通过抑制IL-17 的表达发挥对UC 的治疗作用。活性氧（reactive oxygen species，ROS）的过量累积导致细胞膜通透性增加，促进炎症反应［16］。研究发现在UC 肠道黏膜中会过量生成ROS，促进组织损伤［17］。这些研究进一步佐证了新橙皮苷可能通过调控MAPK 信号通路、IL-17 信号通路、活性氧相关通路来发挥其对溃疡性结肠炎的保护作用。

本研究通过构建新橙皮苷治疗UC 的潜在作用靶点PPI 网络图，发现MAPK14（p38）、CASP1、PTGS2 等靶点可能参与新橙皮苷治疗UC 的作用机制。陈赛等［18］研究证实白芍七物颗粒干预UC 小鼠，能降低p38 的磷酸化水平，通过阻断NOXs-ROS-p38 信号通路的传导，缓解UC 小鼠结肠组织的炎症反应；EPSTEIN 等［19］研究证实，姜黄素可通过阻断p38 MAPK 信号通路，减轻结肠黏膜组织的白细胞浸润，有效治疗DSS 诱导的UC 小鼠的结肠炎性病变。Caspase-1 是介导细胞焦亡所依赖的核心蛋白，它的激活是细胞焦亡经典途径的核心，属于免疫系统的重要组成部分［20］。研究表明，人炎性肠组织中Caspase-1 活化水平比正常肠组织中活化水平更高［21］。PTGS2 在调控免疫应答发挥重要作用，主要表达在单核细胞和肠上皮细胞中，在UC发展过程中对结肠黏膜愈合有促进作用［22］。这些研究提示新橙皮苷可能通过MAPK14（p38）、CASP1、PTGS2 等关键靶点的表达水平，调控相关免疫应答，治疗DSS 诱导的UC 小鼠的结肠炎性病变。

UC 的主要临床表现是腹痛、腹泻、黏液脓血便等，DSS 为经典的UC 造模方法，利用DAI 评分能反映该模型中UC 体质量下降、腹泻、黏液脓血便情况。本研究体内实验中DSS 造模后的UC 小鼠出现了明显的DAI 评分升高和体质量下降，而新橙皮苷可显著降低DSS 诱导的UC 小鼠体质量下降和DAI评分升高，结果表明新橙皮苷可缓解DSS 诱导的UC 小鼠的UC 体质量下降、腹泻、黏液脓血便症状。再以该模型验证网络药理学分析富集出的MAPK14（p38）关键靶点，通过体内实验的验证，可得出以下结果：在DSS 诱导的UC 小鼠模型中，新橙皮苷干预能够显著逆转模型组小鼠结肠组织中p38 蛋白磷酸化水平的升高，提示新橙皮苷对UC 的治疗作用可能是通过发挥对p38 MPAK 通路的抑制而实现。

综上，本研究通过网络药理学对新橙皮苷治疗UC 的相关分子机制进行探讨。采用体内实验对新橙皮苷调控p38 MPAK 信号通路，进而起到抑制UC 的发生、发展进行验证，为临床中研发防治UC的药物提供了有效的依据。不足之处在于，研究中仅对p38 MPAK 信号通路进行了探索验证，并未对该通路上下游相关通路蛋白进一步分析，计划在下一步的实验中进行探究。