宣木瓜药材烫晒法有效物质含量变化及干燥工艺优化

查孝柱，谢晓梅，查光圣，曹 富，徐 源，查娇娇，檀 啸

(1.安庆医药高等专科学校 药学院，安徽 安庆 246052；2.安徽中医药大学 药学院，安徽 合肥 230031；3.安徽光盛农业股份有限公司，安徽 安庆 246632)

宣木瓜始载于《名医别录》，为常用中药，具有平肝舒筋、和胃化湿的功效。《中华人民共和国药典》规定为蔷薇科植物贴梗海棠(Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai)的干燥近成烫果实。[1]宣木瓜与宁夏枸杞、川杜仲、藏红花并列为我国的四大名药，具有很高的药用价值。[2]近年来，安徽医科大学、安徽中医学院、安徽农业大学等相关学者在宣木瓜的种质资源、本草考证、化学组成、质量评价分析和现代药理学等方面进行了较为深入的研究和探索;[3-18]但有关宣木瓜药材烫晒加工方面的研究报道甚少。

木瓜一般在夏、秋二季果实绿黄时采收，药典规定加工方法是“置沸水中烫至外皮灰白色，对半纵剖，晒干”(俗称烫晒法)。我们调研发现，目前木瓜的产地加工方法主要有生晒法与烫晒法两种，前者指将木瓜纵剖后直接晒干，后者则指经沸水烫透后再晒干，一般认为，烫晒法干燥时间较生晒法略短，但是在一周内遇到阴雨天则更容易霉烂。实际上，随宣木瓜产量增大，烫晒法因消耗大量薪柴而被药农渐渐停用，主要采用生晒法，与药典要求不相符合。宣木瓜采收加工时值梅雨天，在晒干过程中常遭遇阴雨天气导致药材霉烂虫蛀，药农遇此情况则改用烘干法；当地有企业在产地收购宣木瓜鲜品进行集中人工控制条件加工，但存在加工工艺不一致，加工过程质量监控薄弱，工艺参数缺乏科学资料支撑等现象。

针对宣木瓜目前产地加工状态和存在的问题，本课题组将研究生晒法对药材质量的影响，通过与烫晒法的药材进行质量比较，探索人工控制条件的加工技术和最佳工艺，力求推出不受不良天气影响，人工控制条件下的适宜加工方法；依据《中国药典》和木瓜物质组成、性质等，增加过程控制和质量评价。该研究将对阐明木瓜传统加工方法的原理、建立宣木瓜药材规范统一、科学合理的加工方法、对提高宣木瓜药材质量、促进宣木瓜加工产业化、保障宣木瓜在中医临床应用中的稳定、安全及出色疗效的发挥，对保护宣木瓜资源、传承药用最佳的美誉，提升宣木瓜的品牌效应和市场竞争力等有着重要意义和实用价值。宣木瓜主要有效成分是山楂酸、齐墩果酸和熊果酸,[4-20]针对主要有效成分进行工艺优化才有重要的科学意义。

1 仪器与材料

仪器：安捷伦LC-1260 HPLC色谱分析仪，德国赛多利斯公司十万分之一的BP211D电子天平；昆山市超声仪器有限公司的KQ-250DB型数控超声波清洗器。

材料：山楂酸对照品(批号：141201)、齐墩果酸对照品(批号：140824)、熊果酸对照品(批号：141118)，分析纯甲醇(上海苏懿化学试剂有限公司)，超纯水，冰醋酸(上海润捷化学试剂有限公司)，三乙胺(江苏强盛功能化学股份有限公司)，色谱纯甲醇(欧普森)。

2 方法

2.1 药材收集

宣木瓜药材采自安徽省宣城市宣州区新田镇道地产区，经安徽中医药大学药学院彭华胜教授鉴定为蔷薇科植物贴梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai的果实。

2.2 不同加工方法制备样品

2.2.1 烫晒法

将新鲜宣木瓜入沸水中烫2～3 min，捞出，纵剖，先将切面向上晒数日，再翻过来晒，日晒夜露直至晒干，编号为A。将新鲜宣木瓜入沸水中烫2～3 min，捞出，纵剖，切片，晒法同烫晒法，编号为G。

2.2.2 生晒法

将新鲜宣木瓜纵剖后，晒法同烫晒法，编号为B。将新鲜宣木瓜纵剖，切片，晒法同烫晒法，编号为E。

2.2.3 烘干法

将新鲜宣木瓜入沸水中烫2～3 min，捞出，纵剖，切片，在60℃烘48 h至烘干，编号为C。将新鲜宣木瓜入沸水中烫2～3 min，捞出，纵剖，在60℃烘48 h至烘干，编号为D。将新鲜宣木瓜入沸水中烫2～3 min，捞出，纵剖，在60℃烘48 h至烘干，蒸汽蒸15 min，切片，再在在60℃烘48 h至烘干，编号为H。将新鲜宣木瓜入沸水中烫2～3 min，捞出，纵剖，在60℃烘48 h至烘干，润48 h，切片，再在60℃烘48 h至烘干，编号为I。将新鲜宣木瓜直接切片100℃干燥20 min，然后60℃干燥48 h，编号为F。

2.3 山楂酸、齐墩果酸和熊果酸含量测定

2.3.1 色谱条件

Shim-pack CLC-ODS(M)色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相甲醇-水-冰醋酸-三乙胺的比为265∶35∶0.1∶0.05；检测波长是210纳米；流速：0.6毫升每分钟；柱温：20度；进样量20微升；理论塔板数在15000以上。[1,19]

2.3.2 对照品溶液的制备

精密称取山楂酸对照品0.06 mg、齐墩果酸对照品1.78 mg和熊果酸对照品0.83 mg，加甲醇定容至10 mL。

2.3.3 供试品溶液的制备

取宣木瓜细粉(过6号筛)约0.5 g，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞。超声处理(功率250 W，频率40k Hz)15 min，摇匀，放冷，过滤上清液，即得。色谱图见图1。

图1 混合对照品色谱图及宣木瓜饮片色谱图

2.3.4 线性关系考察

取山楂酸、齐墩果酸、熊果酸混合对照品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件，依次进样0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0以及10.0 μL，测定对照品吸收峰面积。以进样量(μg)为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程：山楂酸Y=0.47 178X-2.346 1，r=0.9999、齐墩果酸Y=0.472178X-2.3471，r=0.9999；熊果酸Y=0.58128X-3.04，r=0.9999。表明山楂酸在0.0510～5.749 μg、齐墩果酸在0.0701～5.953μg和熊果酸在0.0802～5.839 μg范围内进样量与峰面积积分值线性关系好。

2.3.5 精密度试验

精密吸取对照品溶液，连续进样6次，结果山楂酸峰面积RSD=1.36%齐墩果酸峰面积RSD=1.30%，熊果酸峰面积RSD=1.59 %，表明精密度好。

2.3.6 重复性试验

取同一份样品(A)粉末6份，按“2.5.3”项下方法制备，进样测定，结果山楂酸峰面积RSD=2.31 %，齐墩果酸峰面积RSD=2.47 %和熊果酸峰面积RSD=2.05 %，表明重复性好。

2.3.7 稳定性试验

取同一份供试品溶液(A),在0、4 h、12 h、24 h、36 h、48 h进样测定，结果山楂酸峰面积RSD=1.34 %，齐墩果酸峰面积RSD=1.67 %，熊果酸峰面积RSD=1.82 %，表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.3.8 加样回收率试验

取已知含量的宣木瓜样品(A)粉末5份，每份约0.25 g，分别按1∶1质量水平加入山楂酸、齐墩果酸和熊果酸对照品，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液并进行测定，计算加样回收率。山楂酸加样回收率为99.98 %，RSD=2.95 %；齐墩果酸加样回收率为99.89 %，RSD=2.79 %；熊果酸加样回收率为100.00 %，RSD=2.78 %。表明本方法准确度好。

3 结果

分别取不同样品进行样品含量测定，按“2.3.3”项下方法制备并进行测定。结果见表1。从表中提示：宣木瓜山楂酸含量最高是烘干法，达到0.0079；宣木瓜齐墩果酸含量最高是烫晒法，达到0.5259；宣木瓜熊果酸含量最高是烘干法，达到0.291；宣木瓜总三萜酸含量最高是烫晒法，达到0.7926。在不同的宣木瓜产地加工方法中，山楂酸含量变化范围为0.0071-0.0078，相差0.0007；齐墩果酸含量变化范围0.2997-0.5259，相差0.2262；熊果酸含量变化范围0.1857-0.291，相差0.1053；总三萜酸含量变化范围0.5801-0.7926，相差0.2125。提示宣木瓜产地加工方法对齐墩果酸影响最大，对山楂酸影响较小。

表1 不同宣木瓜加工方法三萜酸含量

4 讨论

4.1 色谱条件的建立

采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱 Shim-pack CLC-ODS(M)(4.6 mm×250 mm，5 μm)，考察甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-水系统，并在流动相中加入磷酸、氢氟酸、冰乙酸和三乙胺酸碱性调节试剂。不同木瓜加工样品在流动性为甲醇-水-冰乙酸-三乙胺(265∶35∶0.1∶0.05)中山楂酸、齐墩果酸和熊果酸之间以及它们与共存组分之间分离度均能达到1.5以上。通过二极管阵列检测器在205～220 nm波长范围检测山楂酸、齐墩果酸和熊果酸的峰面积，以210 nm处有高的检测响应和低噪音干扰，所以确定检测波长为210 nm。考察20～40℃柱温下分离组分的色谱分离情况，发现20℃柱温有很好的分离效果。在所建立的色谱条件下，山楂酸、齐墩果酸和熊果酸之间分离度均较好(R>1.60)，与相邻组分色谱峰分离度也达到规定要求；山楂酸、齐墩果酸和熊果酸的保留时间分别为18.4 min、35.8 min和37.7 min。

4.2 供试品溶液的制备

考察了甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯和乙醚提取溶剂，结果表明甲醇和乙酸乙酯作为提取溶剂时山楂酸、齐墩果酸和熊果酸提取效率较高；从经济考虑，本实验采用甲醇为提取溶剂，并对溶剂用量进行试验。考察提取溶剂体积(mL)与药材质量(g)比为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1和50∶1进行试验，确定加甲醇体积为25 mL。考察了加热回流、超临界萃取、索氏提取、超声与浸渍5种不同提取方式，结果表明超声的提取率较高，本实验采用超声提取方式；并对超声时间10 min、15 min、20 min、25 min和30 min进行考察，结果表明：超声时间对宣木瓜中山楂酸、齐墩果酸和熊果酸的提取率有明显改变，本实验采用功率为250 W、频率为40k Hz超声处理15 min。

4.3 不同加工方法宣木瓜样品山楂酸、齐墩果酸与熊果酸的特征性检测

考察不同加工方法的宣木瓜山楂酸、齐墩果酸与熊果酸的分离检测中发现，所用的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱需要考虑C18色谱柱的填料的粒径和色谱柱的柱长。考察了填料5 μm粒径Shim-pack CLC-ODS(M)柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、大连依利特Hypersil ODS2柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Lab Instrument CO，LTD Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Welch Materials Ultimate XB C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、GL Sciences Inc.Inertsil ODS-SP柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Grace Apollo C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Welch Materials，Inc.Welch Materials Ultimate XB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Shim-pack VP-ODS柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)和填料3 μm粒径YMC-Pack Pro C18柱(4.6 mm×150 mm，3 μm)等色谱柱结果显示，山楂酸、齐墩果酸和熊果酸在填料5 μm粒径的C18柱、250 mm的柱长和20℃的柱温能达到好的分离效果。在建立的色谱条件下，不同产地加工方法的宣木瓜样品中的山楂酸、齐墩果酸和熊果酸之间分离度均较好(R>1.60)，与相邻组分色谱峰分离度也达到中国药典规定要求。

5 结论

(1)本研究建立了山楂酸、齐墩果酸和熊果酸的宣木瓜含量高效液相色谱方法，可以扩大到含有山楂酸、齐墩果酸和熊果酸的中药材、中药饮片和中成药。

(2)本研究以山楂酸、齐墩果酸和熊果酸的含量为考察指标，设计了烫晒、生晒和直接烘干3个的不同产地加工方法，对宣木瓜的加工方法进行了考察，研究在不同干燥方法下宣木瓜山楂酸、齐墩果酸和熊果酸的含量上的规律，结果显示，烫晒法在三萜酸含量上均高于生晒法，这与朱晨晨[9]硕士论文相符；表明药典规定的传统加工方法烫晒法是自然条件下优选宣木瓜干燥的科学方法，也提示了宣木瓜传统加工烫晒法的科学内涵。宣木瓜不同产地加工方法对其中山楂酸、齐墩果酸、熊果酸的含量有显著影响，宣木瓜药材经果烫、晒、蒸、烘等加工处理，可以提高山楂酸、齐墩果酸和熊果酸的总含量，但是其中山楂酸含量变化不大而齐墩果酸和熊果酸含量变化很显著，进一步证明了山楂酸、齐墩果酸和熊果酸对热的稳定性，提示了宣木瓜药材烫晒法的产地加工方法的科学性。与王晓阁[20]研究不同产地加工法对宣木瓜药材中齐墩果酸和熊果酸的热稳定性一致。

(3)生晒法中切半晒在三萜酸上均高于生晒法中切片晒烫晒法中切半均高于烫晒法中切片。在新鲜木瓜切制成饮片的方法中，在三萜酸含量上，烫晒后烘48 h用水润48 h再在60℃烘48 h的方法比烫晒后烘48 h用蒸汽蒸15 min再在60℃烘48 h方法主要化学成分含量高。结果表明最佳干燥成药材的方法是烫晒，其主要有效化学成分山楂酸、齐墩果酸和熊果酸分别是0.0076、0.5259和0.2571，总三萜酸为0.7926；发现最佳干燥成饮片的方法为烫晒后烘48 h用水润48 h再在60℃烘48 h的方法，其主要有效化学成分含量高，山楂酸、齐墩果酸和熊果酸分别是0.0071、0.4425和0.291，总三萜酸为0.7406。