外周血miR-497表达在缺血性脑卒中诊断和预后评价中的应用

赵云肖，曾柳苑

摘要目的：研究外周血miR-497 mRNA表达水平对不同类型缺血性脑卒中的诊断价值及预后预测效能。方法：入选我院收治的650例缺血性脑卒中病人，经临床诊断后将病人分为短暂性脑缺血发作（TIA）组、可逆性脑缺血损伤（RIND）组、进展性卒中（SIP）组和完全性卒中（CS）组。另选取同期在我院体检的健康体检者50名纳入对照组。采用荧光定量聚合酶链式反应（PCR）法检测外周血血清中miR-497 mRNA表达水平，比较不同类型缺血性脑卒中病人和对照组miR-497表达水平，并进行9个月随访。采用受试者工作特征（ROC）曲线分析miR-497对不同类型缺血性脑卒中的诊断效能及对病人预后的预测效能。结果：脑卒中病人入院时血清miR-497表达水平低于对照组（P＜0.001），4组间的miR-497水平比较差异有统计学意义（P＜0.001）。脑卒中病人出院时miR-497水平高于入院时（P＜0.05），4组间的miR-497水平比较差异有统计学意义（P＜0.001）。ROC曲线显示：入院时miR-497水平诊断缺血性脑卒中的ROC曲线下面积（AUC）为0.729，最佳诊断阈值为＜4.902，敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为73.85%、70.00%、96.97%、17.07%。出院时miR-497水平预测缺血性脑卒中病人预后良好的AUC为0.614，最佳诊断阈值为＜2.720，此时预测敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为30.96%、95.33%、93.10%和40.40%。结论：缺血性脑卒中病人血清miR-497水平明显下降，且miR-497水平降低提示缺血性脑卒中病人病情进展和预后不良。

关键词缺血性脑卒中；miR-497；疾病进展；预后

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.08.030

脑卒中是一种急性脑血管疾病，在中老年人中发病率较高。根据世界卫生组织2012年报告，脑卒中已经成为全球范围内仅次于冠心病和癌症的第三大死亡原因。目前认为，脑卒中发病是由于脑血管破裂或阻塞，导致血流不能完成正常的脑循环，脑组织氧化应激和炎性损伤［1］。缺血性脑卒中是脑卒中最常见的类型，占所有病例的60%～70%［2］。临床上对缺血性脑卒中的诊断和治疗较为复杂，主要通过相关血液学标志物结合头颅影像进行诊断［3］。但一直缺少良好的血清学指标用于缺血性脑卒中的筛查、诊断和预后评价，造成部分病人无法及时预防、干预和治疗，造成不可逆的神经损伤，甚至危及生命。研究发现，miR-497在脑梗死等多种脑血管疾病的发生和进展中起到重要作用［4］。Chen等［5］经过大鼠实验发现，抑制miR-497表达通过增强年轻和老年大鼠的神经元自噬改善缺血性中风后的功能结果。Zhong等［6］则发现miR-497低表达可能导致缺血性脑卒中进展。但目前尚鲜见关于miR-497与缺血性脑卒中病人诊断和预后关系的研究报道。本研究旨在探究miR-497在缺血性脑卒中病人外周血的表达及其与预后的关系，现报道如下。

1资料与方法

1.1临床资料

选取2020年2月—2021年6月我院收治的650例缺血性脑卒中病人，经临床诊断后分为短暂性脑缺血发作（transient ischemic attack，TIA）197例、可逆性脑缺血损伤（reversible ischemic neurologic deficit，RIND）190例、进展性卒中（stroke in progression，SIP）181例、完全性卒中（complete stroke，CS）82例。另选取同期在我院体检的健康体检者50名纳入对照组。5组临床资料比较差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。详见表1。本研究经医院伦理委员会审核通过。

1.2纳入与排除标准

纳入标准：1）符合《2018美国卒中协会/美国心脏协会急性缺血性卒中病人早期管理指南》［7］中缺血性脑卒中的诊断标准；2）接受早期溶栓治疗；3）无脑卒中常规药物禁忌证；4）接受随访；5）未接受相关治疗；6）已签署知情同意书。排除标准：1）伴有恶性肿瘤、心脑血管疾病者；2）合并有免疫系统疾病者；3）合并有急性感染或在入院1个月内接受过抗生素治疗者；4）无法配合检查者；5）入院前3个月有手术史者；6）妊娠期或哺乳期女性；7）预期寿命＜1个月者；8）非初诊病人。

1.3治疗方案

入院后所有病人均按照《2018美国卒中协会/美国心脏协会急性缺血性卒中病人早期管理指南》进行治疗，予以头颈部血管造影、明确静脉溶栓或机械取栓方案，并后续予以抗血栓或抗凝治疗［7-8］。

1.4miR-497测定

病人在入院时和出院时采集5 mL空腹静脉血，对照组在体检时采集5 mL空腹静脉血。室温中静置30 min后，于4 ℃、1 500 r/min离心15 min，收集上层清液储存于－80 ℃冰箱待测。采用miRNA提取分离试剂盒（北京天根）提取血清中总RNA。以总RNA为模板，采用PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time）反轉录试剂盒（TaKaRa）合成互补DNA（complementary DNA，cDNA）。利用RealMaster Probe Kit试剂盒（北京天根）进行实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测miR-497表达水平。其中正向引物序列为：3′-GGGGTTAACCAATTGG-5′，反向引物序列为：3′-TTTAAGCGGCCTATA-5′。所有反应设置3个复孔和无模板的阴性对照，并以β-actin mRNA为内参，计算标准化2－ΔΔCt值。

1.5随访与预后判断

病人出院后进行9个月随访，每个月通过门诊、电话等方式进行随访，内容包括病人的精神状态、用药情况、恢复情况等。在末次随访时根据改良Rankin量表（mRS）评分评估病人预后情况：mRS评分＞2分，表明病人预后不良；mRS评分≤2分，表明病人预后良好。

1.6统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行统计学处理和分析。符合正态分布的定量资料采用均数±标准差（x±s）表示，两组间采用独立样本t检验进行比较，多组间采用One-way ANOVA和最小显著差异性（LSD）post-hoc检验进行比较；定性资料采用例数和百分比（%）表示，比较采取χ2检验。采用受试者工作特征曲线（receiver operation characteristics，ROC）分析miR-497对预后的预测意义，计算ROC曲线下面积（area under curve，AUC）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1血清miR-497在脑卒中病人中的表达水平

入院时，脑卒中病人血清miR-497相对表达水平为4.09±1.23，显著低于对照组的5.64±1.79（t＝－7.759，P＜0.001）；TIA组、RIND组、SIP组、CS组脑卒中病人的miR-497水平比较差异有统计学意义（F＝252.366，P＜0.001），其中TIA组最高，CS组最低。出院时，各组脑卒中病人的miR-497水平较入院时升高（t＝3.482，P＜0.001），4組间miR-497水平比较差异有统计学意义（F＝226.082，P＜0.001），其中TIA组最高，CS组最低。详见表2。

2.2血清miR-497对脑卒中病人的诊断价值

采用ROC曲线对所有病人入院时miR-497表达进行分析，AUC为0.729，对于脑卒中的最佳诊断阈值为＜4.902，详见图1。此时敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为73.85%、70.00%、96.97%、17.07%。对于4种不同类型脑卒中，miR-497的诊断阈值及相应敏感度、特异度、AUC见表3。

2.3不同预后结局脑卒中病人miR-497水平比较

根据mRS评分结果，650例病人中有214例预后不良，436例预后良好，其中TIA组、RIND组、SIP组和CS组分别有43例、57例、72例和42例预后不良。各类型脑卒中预后良好组病人miR-497表达水平高于预后不良组（P＜0.05）。详见图2。

2.4出院时miR-497水平对预后的预测价值

对所有650例病人进行为期9个月的随访，成功随访到584例病人，随访成功率为89.85%。对病人的预后进行mRS评分，并采用出院时miR-497水平预测病人的预后情况。结果显示，出院时miR-497表达水平预测脑卒中预后良好的ROC曲线的AUC为0.614，最佳诊断阈值为2.720，此时预测敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为30.96%、95.33%、93.10%和40.40%。详见图3。

3讨论

缺血性脑卒中是一种发病率较高的心血管疾病，严重威胁人类生命健康和生活质量，目前对于缺血性脑卒中的诊断主要依赖于体格检查和影像学，且缺乏对其复发诊断的检测方法［9］。探讨缺血性脑卒中发病的分子机制目前仍是临床研究的难点和热点［10］。miRNAs是一种20～24个核苷酸长度的非编码RNA，在各种生物通路中发挥重要作用，在对环境变化和应激的细胞响应中具有特定重要性，可以在血液、体液、组织和细胞等多种生物标本内检测［11-12］，可以用于疾病大规模临床筛查，能够提高缺血性脑卒中的早期诊断效率［13-14］。miRNA能够通过RNA诱导沉默复合体降解或阻止靶信使RNA翻译，从而参与调节靶蛋白的合成。在神经病学领域，miRNs被认为是大脑发育过程和病理事件的潜在调控因子。在缺血缺氧应激后，细胞和分子事件引发了不同miRNAs的表达失调，导致神经元损伤的长期进展和扩大。由于其具有调节靶蛋白合成的能力，miRNA成为调控脑缺血事件后神经元损伤的一种可能的治疗策略。

miR-497属于miR-15/107基因家族，该家族中miR-195在其他研究中也被发现在神经系统疾病中存在异常表达。Sinoy等［15］研究发现缺血性脑卒中小鼠模型miR-497表达水平上调，并可能通过影响神经元死亡促进疾病进展。 Yin等［16］研究也认为miR-497过表达会导致小鼠神经元丢失，加速脑卒中病情进展，并影响预后。然而有研究表明miR-497在局灶性脑缺血中表达降低［17］。其他关于脑卒中以及脑缺氧缺血性损伤和miRNAs的研究报道中，均倾向于miR-497和miR-369可能通过影响细胞对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的反应在脑神经元坏死性凋亡过程中发挥作用。

本研究发现相对于健康人群，缺血性脑卒中病人外周血miR-497水平降低，也证实了miR-497异常低表达与脑卒中发病和进展相关。已有研究发现miR-497能够降低白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和TNF-α等促炎因子表达水平［18］，对于缺血性脑卒中病人，miR-497水平降低可造成上述促炎因子表达增加，进而造成脑卒中病情进展。而关于脑膜瘤与miR-497的研究发现，脑膜瘤病人血清miR-497水平显著低于正常人，高级别病人miR-497水平更低［19］。

此外，本研究还发现，4种不同类型脑卒中病人入院时外周血miR-497表达水平存在显著差异，其中CS病人水平最低，TIA病人水平最高，这说明miR-497水平降低可能与缺血性脑卒中进展和严重程度相关。通过ROC曲线分析入院时miR-497在脑卒中诊断中的效能，结果显示ROC曲线下面积为0.729，最佳诊断阈值为4.902时，此时预测脑卒中发生的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为73.85%、70.00%、96.97%、17.07%。对不同类型缺血性脑卒中诊断价值方面，病情越严重的类型，入院时miR-497表达水平的诊断性能越高，AUC、灵敏度和特异度越高。

进一步的随访发现，预后良好病人出院时的miR-497表达水平更高，出院时miR-497表达水平预测脑卒中预后良好的AUC为0.614，最佳诊断阈值为2.720，此时预测灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为30.96%、95.33%、93.10%和40.40%。这也进一步表明了miR-497对缺血性脑卒中的诊断和预后的预测具有一定的价值。

综上所述，缺血性脑卒中病人血清miR-497水平明显下降，且miR-497水平降低提示了缺血性脑卒中病人病情严重进展和预后不良。本研究仍存在一些不足。首先，本研究虽然样本量较大，但仅为单中心研究，样本代表性不足；其次，本研究证明了miR-497与缺血性脑卒中有一定的关系，但并未对miR-497在不同性别、不同年龄的健康者与脑卒中病人间的表达进行对比，同时并未明确血清中miR-497在脑脊液中表达的相关性，最后，本研究所涉及的随访周期较短，miR-497水平对脑卒中病人长期预后的影响评估不足。

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（收稿日期：2022-09-06）

（本文編辑王雅洁）