不同贮青温度及方式对红碎茶品质的影响

林冬纯，胡 蝶，陈 维，夏红玲，乔小燕，苗爱清，马成英

（广东省农业科学院茶叶研究所，广东省茶树资源创新利用重点实验室，广东 广州 510640）

红碎茶是国际市场的大宗产品，我国从20世纪50年代开始试制生产，其品质主要受原料质量和加工工艺的影响。提高红碎茶品质的研究报道很多，如桂香红碎茶加工技术[1]、不同萎凋时间对CTC（crush，tear，curl）红碎茶品质的影响[2]、高茶黄素大叶种红碎茶的研制[3]等，但这些研究主要阐述加工过程对红碎茶品质的影响，而关于茶青影响红碎茶品质的研究甚少。

茶青是指从茶树采摘下来的鲜活芽叶，是茶叶加工的原料，如果其在采摘、运输和存放过程中保存不当会导致茶鲜叶劣变，最终影响其成品茶品质[4-5]。茶鲜叶劣变主要受叶温、氧气、茶青水分、茶青堆放时间和机械损伤等影响[6]，因此，为茶鲜叶贮放创造适宜的环境条件，延长茶鲜叶的保存时间，有助于长途运输及适时加工。茶鲜叶的贮青保鲜与温度密切相关，有研究表明10～13 ℃处理能对茶青起到较好的保鲜作用[7]。Hu Die等[8]发现不同处理温度茶青释放的挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs）组分不同，多个与VOCs生物合成相关的基因在低温和常温处理下具有相似的表达趋势，但是这些基因的表达变化在低温环境会延迟出现。

鉴于目前关于贮青温度及方式对红碎茶品质影响的研究鲜有报道，因此，本研究以英红九号茶鲜叶为原料，采用控温15、25 ℃，常温以及沤红这4 种贮青处理制成的红碎茶为研究对象，通过感官审评、生化成分测定及挥发性物质检测，比较不同贮青方法对红碎茶品质的影响，旨在为茶青管理及红碎茶的品质提高提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红茶样品采用英红九号一芽二叶茶青进行红碎茶加工，由广东省农业科学院茶叶研究所英德基地提供。

C7～C30饱和正构烷烃、癸酸乙酯（均为色谱纯）德国Merck公司；甲醇、福林-酚、乙酸乙酯、蒽酮（均为分析纯）上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

YS-XCAB气调实验箱 杭州屹石科技有限公司；便携式分光光度计 美国Datacolor公司；高速粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司；HWS28型电热恒温水浴锅上海一恒科学仪器有限公司；SC-3616离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；752N紫外-可见分光光度计上海菁华科技仪器有限公司；Milli-Q 净水系统德国Merck Millipore公司；RTC12多功能自动进样系统、DVB/CarbonWR/PDMS Smart SPME Arrow萃取头（1.1 mm，120/20 μm）瑞士CTC Analytics AG公司；8890-5977B气相色谱-质谱联用仪、DB-Wax毛细管色谱柱（60 m×0.32 mm，0.25 μm）美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 鲜叶的处理

将40 kg茶鲜叶分成4 份，分别采用15、25 ℃，常温和沤红处理这4 种方法进行贮青，处理时间为8 h，环境相对湿度为65%～75%。15 ℃处理和25 ℃处理于调温箱进行，茶鲜叶摊放厚度为10 cm；常温处理于不控温的加工厂房中进行，温度范围为22～28 ℃，摊放厚度为10 cm；沤红处理采用竹框（25 cm×22 cm×18 cm）堆放茶鲜叶，其堆放叶量为270 kg/m3（GB/T 31748—2015《茶鲜叶处理要求》要求装叶量不超过150 kg/m3），茶青温度36～37 ℃。

当贮青结束时，采用红碎茶工艺加工成毛茶：先用旋叶式滚切机进行滚切，通过筛子（4 mm方孔）筛选，然后将这些破碎的叶子发酵1 h；发酵结束后，先在100 ℃干燥0.5 h，然后在80 ℃干燥至含水量约为6%，所有实验重复3 次。毛茶样品编号分别为15 ℃贮青（BX-1）、25 ℃贮青（BX-2）、常温贮青（BX-3）、沤红贮青（BX-4）。

1.3.2 感官审评

根据GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》中的红碎茶审评法进行审评，感官评价得分是加权平均值，以标准中外形（20%）、汤色（10%）、香气（30%）、滋味（30%）和叶底（10%）这5 项因子的综合评分作为样品品质高低的判定依据，综合评分大于90 分的样品为高等级，低于90 分的样品判定为低等级。感官评价由3 位审评专家独立进行。

1.3.3 茶叶样品处理

茶叶样品处理与茶汤色差、挥发性物质的检测条件参考文献[9-10]的方法稍作改进；可溶性糖采用比色法[11]测定；茶色素采用系统分析法[12]测定；茶多酚、氨基酸的测定分别参照GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》、GB/T 8314—2013《茶游离氨基酸总量的测定》。所有实验重复3 次。

样品处理：研磨成细粉末，在-80 ℃密封保存，用于化学检测。

茶汤色差测定：茶汤采用GB/T 23776—2018中红碎茶审评标准制得，再采用便携式分光光度计对样品的颜色坐标（CIE Lab）进行定量。

挥发性成分测定前处理：称取茶粉（1.000±0.005）g置于20 mL顶空瓶中，加入100 μg/mL癸酸乙酯-正己烷溶液2 μL并迅速拧紧瓶盖，各样品重复3 次；接着将顶空瓶置于加热振荡器中，60 ℃平衡5 min；随后使用DVB/CarbonWR/PDMS萃取头进行萃取，萃取温度60 ℃，萃取时间40 min。

1.3.4 气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）检测

色谱分析条件：载气为高纯氦气（99.9%），流量为1 mL/min；程序升温的初始柱温为35 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min升温至250 ℃，不保持。总分析时间为45 min。

MS条件：电子电离源；电子能量70 eV；传输线温度和离子源温度均为230 ℃，四极杆温度150 ℃；运行全扫描模式，质量扫描范围m/z35～350；溶剂延迟时间7.5 min。

1.4 数据处理与分析

茶汤色差数据处理：测量后，计算9 个值的平均值作为每个样品的平均颜色数据。统计分析采用单因素方差分析，采用Duncan多量程检验。

茶色素数据处理：所测定的吸光度按照系统分析法中的公式进行换算，得到茶黄素（theaflavin，TF）、茶红素（thearubigin，TR）和茶褐素（theabrownine，TB）的含量。

氨基酸、茶多酚、可溶性糖数据处理：配制5 个以上不同质量浓度的标准溶液，以标准溶液质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y），绘制氨基酸、茶多酚、可溶性糖的标准曲线，得出回归方程，然后根据标准曲线进行计算分析。

挥发性成分数据处理：由GC-MS检测所得的原始数据利用Masshunter工作站中的未知物分析软件10.0进行处理。化合物的定性以质谱数据（匹配度得分大于70.0）和线性保留指数（偏差在10 个单位内）为依据，两者均与NIST 17数据库比对。挥发性物质含量通过下式以癸酸乙酯为内标校正求得：

对定性和定量后的化合物数据依次进行以下前处理：1）按每种化合物最小值的1/5执行缺失值填充；2）以每种化合物为一组执行均值方差归一化[13]。

采用Simca软件、Graphpad Prism 7.0软件和TBtools软件作图，采用SPSS 17.0软件进行显著性分析，采用Duncan检验。

2 结果与分析

2.1 不同贮青处理对红碎茶感官品质的影响

如表1所示，25 ℃控温箱的BX-2和在常温条件下的贮青样BX-3茶样的外形特征相近，BX-4外形尚乌褐匀整，BX-1外形乌褐匀整。沤红贮青样BX-4汤色较差，呈红略暗；随着控温温度的升高（15～25 ℃），茶样汤色由较红艳明亮（BX-1）逐渐转为尚红艳明亮（BX-2）；BX-3色泽红艳明亮，优于其他处理。BX-4茶样香气低闷且略带异气，BX-2和BX-3香气较甜香，BX-1香气甜香且高长。BX-4茶样滋味浓醇较强，稍有异味，BX-1和BX-2鲜浓较强，带苦，BX-3鲜浓较强。BX-4茶样叶底红暗，较匀整柔软，BX-2与BX-3叶底特征相近，呈红亮，且较匀整柔软，BX-1叶底红亮且匀整柔软。在4 种茶青贮青处理方法中，采用15 ℃控温贮青的红碎茶综合评分为90.4，高于其他贮青处理的茶样。

表1 不同贮青处理的红碎茶感官审评结果Table 1 Sensory evaluation results of broken black tea prepared from tea leaves subjected to different storage treatments

2.2 不同贮青处理对红碎茶茶汤色差的影响

茶叶品质色差分析法是应用亨特-Lab表色系，其中L代表明度，正、负a值分别表示红、绿色度，正、负b值分别表示黄、蓝色度[14]。由表2可知，L、a、b均为正值，与张杨波等[15]对红碎茶茶汤的色差值研究结果一致。BX-1茶汤L值显著高于其他3 个处理样（P＜0.05），BX-4的L值最低；BX-1、BX-2、BX-3茶汤a值显著高于BX-4（P＜0.05）；BX-1茶汤b值显著低于其他3 个处理样（P＜0.05）。综合而言，茶青贮放方式显著影响红碎茶茶汤色差，茶青采用15 ℃处理的红碎茶样汤色明亮度较高，茶汤颜色较红艳。

表2 不同贮青处理的红碎茶汤色差值比较Table 2 Comparison of color parameters among infusions of broken black tea prepared from tea leaves subjected to different storage treatments

2.3 不同贮青处理对红碎茶茶色素的影响

如表3所示，TF作为红碎茶中色泽橙红、具有收敛性的一类色素，对红茶汤色“亮”有贡献作用[16]，BX-1和BX-2的TF相对含量分别为0.75%和0.78%，显著高于BX-3和BX-4（P＜0.05）。TR是一类复杂的红褐色酚类化合物，对茶汤滋味和汤色浓度有重要的贡献作用[17]，BX-1、BX-2和BX-3的TR相对含量在6.5%～7.0%之间，显著高于BX-4（P＜0.05）。TF和TR含量与红碎茶品质呈显著正相关[18]。TB是造成红茶茶汤发暗、无收敛性的重要因素，其含量与红茶品质高度负相关[19-20]。在4 种贮青处理的红碎茶中，BX-1和BX-3的TB相对含量显著低于其他红碎茶样品（P＜0.05）。综合而言，采用15 ℃贮青的红碎茶更能促进红碎茶形成较好的品质。

表3 不同贮青处理的红碎茶茶色素相对含量Table 3 Pigment relative contents in broken black tea prepared from tea leaves subjected to different storage treatments%

2.4 不同贮青处理对红碎茶儿茶素、氨基酸和可溶性糖的影响

如表4所示，茶多酚是构成茶叶滋味物质的重要成分，与茶汤滋味的苦涩、浓强以及收敛性相关，在红茶加工过程中茶多酚经酶促氧化反应而呈减少趋势[21-22]。BX-1和BX-4的茶多酚含量显著低于BX-2和BX-3（P＜0.05），即低温（15 ℃）处理和沤红劣变的茶青会降低红碎茶的茶多酚含量。

表4 不同贮青处理的红碎茶儿茶素、氨基酸和可溶性糖含量Table 4 Contents of catechins,amino acids and soluble sugar in broken black tea prepared from tea leaves subjected to different storage treatments mg/g

氨基酸是组成茶叶鲜爽和鲜甜滋味的重要物质之一，在茶叶加工过程中参与茶叶香气的形成[23-24]。如表4所示，BX-2的氨基酸含量最高，为34.14 mg/g，BX-4最低，BX-1和BX-3介于两者中间。不同的贮青处理会影响红碎茶的氨基酸含量，沤红劣变的茶青不利于红碎茶氨基酸含量的积累。

可溶性糖能给茶汤带来甜醇的味道，是红碎茶重要的滋味物质[25-26]。BX-1、BX-2和BX-3可溶性糖的含量差异不显著（P＞0.05），但显著高于BX-4（P＜0.05）。茶叶中的可溶性糖含量受鲜叶呼吸作用的影响而减少，在加工过程中其含量也随着单糖的氧化和多糖的水解而变化[27]。茶青采用15 ℃处理有助于红碎茶可溶性糖含量的积累，而沤红劣变的茶青可能因加工前加快了鲜叶的呼吸作用而促进了可溶性糖的消耗，使得其可溶性糖的含量低于其他贮青处理的红碎茶。

2.5 不同贮青处理对红碎茶挥发性物质的影响

如图1所示，4 组茶样挥发性物质种类大致相同，但含量存在一定差异。由表5可知，不同贮青处理的红碎茶共检出已知挥发性物质70 种，BX-1、BX-2和BX-3挥发性物质的总含量均高于BX-4，约为BX-4的2 倍。参考宛晓春[28]对茶叶香气的分类方法，不同贮青处理的红碎茶挥发性物质包括醇类21 种、碳氢类10 种、醛类16 种、酮类7 种、酯类9 种、其他化合物7 种。其中芳樟醇相对含量较高，约占红碎茶样品的30%～40%。芳樟醇是红碎茶典型的特征香气，似铃兰的花香香气[29]，其在BX-1含量为4 8 0 3.9 n g/g，显著高于B X-2、B X-3 和B X-4（P＜0.05）。在特有挥发性物质组分上，己酸己酯（新鲜水果香）和N-己酸(反-2-己烯基)酯（青草味）为BX-1特有，BX-2和BX-3无特有挥发性物质组分，BX-4特有组分有3 种，分别为β-二氢紫罗兰酮（花香）、二氢猕猴桃内酯（香豆素味）和2-乙基吡嗪（坚果香）。这表明贮青方法会影响红碎茶总挥发性物质的含量，同时也影响特有组分的形成。

图1 不同贮青处理的红碎茶挥发性物质总离子色谱图Fig.1 Total ion chromatograms of volatile substances in broken black tea prepared from tea leaves subjected to different storage treatments

表5 不同贮青处理的红碎茶挥发性物质Table 5 Contents of volatile substances in broken black tea prepared from tea leaves subjected to different storage treatments

如图2所示，不同贮青处理的红碎茶挥发性物质中醇类相对含量较高，是构成红碎茶的主体成分，其次是醛类、碳氢类、酯类，酮类。BX-1、BX-2和BX-3中相对含量最高的醇类差异不显著，但显著高于BX-4（P＜0.05），酮类挥发性物质在4 种样品中差异不显著（P＞0.05），而BX-4的碳氢类挥发性物质显著高于BX-1、BX-2和BX-3（P＜0.05），其余各类挥发性的含量在各个样品中的占比有所不同。可见，红碎茶中挥发性组分中醇类贡献较大，这与肖巧梅等[30]对红茶挥发性成分的研究结果一致，但各类挥发性物质实际占比会受到贮青方法的影响，茶青沤红会明显降低红碎茶的醇类物质占比，且会增加碳氢类挥发性化合物的比重。

图2 不同贮青处理对红碎茶挥发性物质相对含量的影响Fig.2 Effects of different storage treatments for fresh tea leaves on the relative contents of volatile substances in broken black tea

对不同贮青处理的红碎茶挥发性物质含量进行正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA），得分如图3A所示。各茶样在95%置信区间内均分布于不同区域，有明显的区分，说明不同贮青处理对红碎茶挥发性物质含量影响较大。分别表示第1主成分贡献率（65.0%）和第2主成分贡献率（14.9%），结果表明这2 个主成分可以反映挥发性物质数据差异，且从第1主成分贡献率可知BX-4的挥发性物质与另外3 种贮青样品存在明显差异。参考徐春晖等[31]的方法，采用200 次响应的置换检验模型是否有过拟合现象，结果如图3B所示，R2＝0.447，Q2＝-0.439，Q2与Y轴的截距为负值，说明本模型预测能力良好，并未产生过拟合现象，可用于特征挥发性物质的筛选。按变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值从大到小排列，筛选出VIP＞1且组间差异显著（P＜0.05）的主要差异挥发性物质，如图4所示。

图3 不同贮青处理的红碎茶挥发性物质OPLS-DA得分图（A）和验证图（B）Fig.3 OPLS-DA score (A) and permutation test (B) plots for variations in volatile substances in broken black tea prepared from tea leaves subjected to different storage treatments

图4 不同贮青处理的红碎茶VIP大于1的挥发性物质热图Fig.4 Heatmap of volatile substances with VIP greater than 1 in broken black tea prepared from tea leaves subjected to different storage treatments

由图4可知，4 种不同贮青处理的红碎茶中共筛选出十二烷、己酸叶内酯和反式-2-辛烯-1-醇等20 种差异挥发性物质，结合表5可知，BX-1的萘、己酸己酯、N-己酸(反-2-己烯基)酯和(E,E)-2,4-庚二烯醛等物质含量显著高于BX-2、BX-3和BX-4（P＜0.05），长叶烯、二氢芳樟醇和顺式-3-己烯醇2-甲基丁酸酯等物质在BX-1、BX-2和BX-3中的含量显著高于BX-4（P＜0.05），BX-4的癸醛、壬醛和(Z)-脱水芳樟醇氧化物含量显著高于其他茶样（P＜0.05）。综上，这20 种差异挥发性物质的构成是不同贮青处理红碎茶香气差异的主要原因。

葛晓杰等[32]通过嗅觉检测器对呈香活性成分的鉴定表明脱氢芳樟醇、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E,E)-1,3,5辛二烯-2-酮在红茶香型中呈香更显著，是甜香型红茶的关键因子。而本研究发现在15 ℃贮青的红碎茶相对含量较高的挥发性物质有水果青香味的己酸己酯、坚果香的(E,E)-2,4-庚二烯醛、呈青草香的N-己酸(反-2-己烯基)酯等物质，结合感官审评结果（表1）可知这些香气物质是影响红碎茶甜香的主要成分，这也表明采用15 ℃贮青能更好地促进红碎茶甜香味的形成。

茶叶香气的形成受到环境因素的影响，在环境胁迫的条件下茶叶会收到的胁迫信号的传导，相应地做出胁迫反应，调控某些香气合成基因的表达，诱导某些香气物质的合成释放，从而使自身更加适应环境变化[33-34]。在茶叶加工中，可以通过对鲜叶进行适度低温处理调控香气的释放，从而达到促进成品茶香气愉悦的目的[35]。本研究结果表明：相较于其他贮青处理，15 ℃处理茶青对红碎茶香气成分有明显影响，当贮青方式不同导致茶青保存温度不同时，红碎茶的特征香气成分发生改变，从而造成不同贮青处理的红碎茶挥发性成分差异。不同贮青处理的红碎茶香气的形成以及成分之间的相互转化机理仍需进一步深入研究。

3 结论

茶多酚、氨基酸、可溶性糖和香气物质等含量可作为判断红碎茶品质优良的指标。不同贮青处理的红碎茶中15 ℃贮青的红碎茶综合评分最高，为90.4，其汤色明亮度较高，茶汤颜色较红艳；茶青采用15 ℃和沤红处理降低了红碎茶中茶多酚总含量；不同贮青处理会影响红碎茶的氨基酸含量，沤红劣变茶青不利于红碎茶氨基酸的积累；茶青采用15 ℃处理有助于红碎茶可溶性糖的积累，而沤红劣变茶青可能会促进鲜叶的呼吸作用而加快可溶性糖的消耗；挥发性物质共测出70 种，醇类物质占比较大，主要差异物有十二烷、己酸叶内酯和反式-2-辛烯-1-醇等20 种物质，15 ℃贮青的红碎茶相对含量较高的挥发性物质有坚果香的(E,E)-2,4-庚二烯醛、呈青草香的N-己酸(反-2-己烯基)酯、水果青香味的己酸己酯，能更好地促进红碎茶甜香味的形成。综合而言，15 ℃贮青能提高红碎茶的鲜爽度、甜度及甜香挥发性物质的含量，更有利于品质形成，该温度是红碎茶贮青的适宜温度，实验结果可为茶青管理及红碎茶品质的提升提供参考。