6-姜烯酚玉米醇溶蛋白纳米颗粒的构建及其生物利用度分析

高 就，吴俊杰，焦文雅，陈宇洋，祝文轩，桑亚新，王向红

（河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071000）

姜是多年生草本植物，作为香料和药物被世界各地广泛消费。姜的药用价值主要来源于其具有的生物活性物质，特别是姜酚及其脱水产物姜烯酚。6-姜烯酚（6-shogaol，6S）是姜中的主要活性成分，具有抗炎[1]、抗癌[2]、抗氧化[3]、改善阿尔茨海默症[4]、改善肥胖[5]等药理作用。但是6S溶解性差、生物利用度低，在体内会被快速吸收和消除，限制其在功能食品领域的应用[6]。

目前已有纳米乳液[7]、脂质体[8]、纳米颗粒[9]等多种输送载体，用于提高难溶性多酚物质的生物利用度。其中，利用食品级基材构建的纳米颗粒作为活性物质的输送载体具有诸多优势而被广泛关注。蛋白质因其独特的结构和功能特性可以用作制备纳米颗粒。多酚与蛋白基纳米载体结合后形成纳米复合物，可提高其溶解度和在胃肠液中的稳定性，并促进小肠上皮细胞对多酚物质的吸收[10]。

玉米醇溶蛋白是玉米中的主要储存蛋白，具有独特的溶解性，不溶于水但可溶于乙醇、丙酮和pH≥11.5的碱性水溶液，易于通过反溶剂法制备纳米颗粒[11]。近年来，玉米醇溶蛋白成为一种流行的植物蛋白，常被用来开发封装和控制疏水活性物质释放的递送载体，如槲皮素[12]、白藜芦醇[13]、姜黄素[14]等。由于玉米醇溶蛋白纳米颗粒稳定性、再分散性差，通常加入稳定剂附着在颗粒表面以改善这些问题，常用的稳定剂有酪蛋白酸钠（sodium caseinate，SC）[15]、壳聚糖[16]、果胶[17]等。其中SC因具有诸多优势而吸引了研究者的注意。除了良好的再分散性，SC能够提高玉米醇溶蛋白纳米粒子在高离子强度下的稳定性，改变玉米醇溶蛋白纳米粒子的等电点，进而通过增强静电排斥阻止纳米粒子在小肠中的聚集[18]。有研究表明，在Caco-2细胞单层模型中，SC能够促进细胞摄取玉米醇溶蛋白纳米颗粒[19]。与壳聚糖相比，以SC为外壳的玉米醇溶蛋白纳米颗粒具有更好的稳定性、再分散性和口服生物利用度[20]。

生物利用度是设计酚类物质递送体系的重要参考因素。评价生物利用度最有效的方法是人体实验，但是存在操作难度大、对样品要求较高、涉及伦理和可及性问题而难以实施。因此常选择其他方法代替，主要有体外模拟胃肠道消化、Caco-2细胞单层模型转运和药代动力学研究。营养物质摄入后需经过口腔、胃、肠消化后被机体吸收利用。建立模拟消化模型，研究营养物质的消化和释放特性，可初步探究其生物可及性。小肠是营养物质的主要吸收场所，Caco-2细胞来源于人体结肠腺癌细胞，在半透滤膜上分化形成的单层膜与人类的小肠上皮细胞相似，可以作为体外模型模拟小肠上皮细胞对营养物质的吸收转运[21]。药代动力学是研究物质及其代谢产物浓度随时间动态变化的方法，运用数学方法计算药代动力学参数，通过最大血药浓度、药时曲线下面积（area under curve，AUC）、半衰期等判断物质在体内的生物利用度。在体外模拟胃肠消化模型和小肠吸收模型的基础上进一步研究营养物质的药代动力学，可以更加准确全面地了解营养物质的生物利用度。

目前，利用蛋白基纳米颗粒作为递送载体提高6S生物利用度的研究鲜见报道。因此，本研究用反溶剂法制备负载6S的玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸钠纳米颗粒（6-shogaol-loaded zein-sodium caseinate nanoparticles，ZCP-6S），对颗粒进行表征，利用体外模拟消化、Caco-2细胞模型和大鼠药代动力学研究颗粒的生物可及性、细胞吸收和口服生物利用度，以期为疏水活性物质的输送及拓宽纳米颗粒的应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

Caco-2细胞购于国家实验细胞资源共享服务平台；SD大鼠体质量为（200±10）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2019-0008。

玉米醇溶蛋白、6S、辣椒素 上海源叶生物科技有限公司；SC 上海麦克林生化科技有限公司；胃蛋白酶（250 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）、DMEM培养基、HBSS缓冲液、四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清 维森特生物技术（南京）有限公司；BCA蛋白试剂盒 赛文创新（北京）生物科技有限公司；6 孔Transwell板 广州洁特生物过滤股份有限公司；甲醇（色谱级）赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.2 仪器与设备

磁力搅拌器 德国IKA公司；RE-52A旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂；FD5-2.5型真空冷冻干燥机 SIM仪器有限公司；1260高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪 美国Agilent公司；Zetasizer Nano ZS90纳米粒度仪 英国Malvern公司；HT7800透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）日本日立公司；IRAffinity-1S型傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform-infrared spectroscopy，FT-IR）日本岛津公司；LYZ-200 B 恒温摇床上海龙跃仪器设备有限公司；MX-F 涡旋混合器美国Scilogex公司；Millicell ERS-2跨膜电阻仪 美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 纳米颗粒的制备

采用反溶剂法制备ZCP-6S[22]。将100 mg的玉米醇溶蛋白分别与50、40、20、10 mg 6S共溶于10 mL体积分数70%乙醇溶液，磁力搅拌1 h，配制不同比例的玉米醇溶蛋白-6S混合溶液。在磁力搅拌下，将该混合溶液缓慢滴入30 mL含有200 mg SC的水溶液中。持续搅拌1 h，用旋转蒸发仪去除溶液中的乙醇，5 000 r/min离心10 min以去除杂质和未封装的6S，得到纳米颗粒溶液，冷冻干燥后的ZCP-6S颗粒粉末于-20 ℃保存。

1.3.2 粒径、多分散性指数（polydisperse index，PDI）和Zeta电位的测定

使用马尔文纳米粒度电位仪测量样品的粒径、Zeta电位和PDI。将样品稀释适当倍数后在25 ℃条件下测定，每个样品重复测定3 次取平均值。

1.3.3 包埋率和固载率的测定

参考Zheng Dan等[22]的方法，用色谱级甲醇将纳米颗粒适当稀释后使用HPLC检测纳米颗粒中包埋的6S含量，计算。液相色谱条件：Diamonsil C18型色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水溶液（70∶30，V/V），等度洗脱；流速为1 mL/min，柱温为37 ℃，检测波长230 nm，进样量为20 μL。包埋率和固载率分别按式（1）、（2）计算：

1.3.4 TEM观察

使用TEM对纳米颗粒进行微观形貌的表征。将样品稀释后用水滴在铜网上，晾干后用TEM观察形貌。

1.3.5 FT-IR分析

采用FT-IR对6S、ZCP-6S、玉米醇溶蛋白与SC质量比为1∶2的混合物（记为Z-SC1∶2）进行红外光谱分析。将样品和溴化钾粉末按照质量比1∶99研磨混合后压片测定，扫描范围为4 000～500 cm-1，分辨率为4 cm-1。

1.3.6 体外模拟胃肠消化

参考Li Duoduo等[23]的方法，模拟胃肠消化模型由模拟胃液（含2 mg/mL NaCl、1.6 mg/mL胃蛋白酶，pH 2.0）和模拟肠液（含10 mg/mL胆盐、3.2 mg/mL胰酶、1.1 mg/mL氯化钙，pH 7.5）组成。首先取一定量的ZCP-6S和含相同质量的游离6S作为对照，加入10 mL模拟胃液，然后在37 ℃恒温摇床中以120 r/min的转速消化2 h。调节pH值为7.5中止消化，将胃消化液与模拟肠液等体积混合后调节混合液的pH值为7.5，在摇床中继续消化4 h。将经过模拟胃肠消化后的消化液10 000 r/min离心，使用HPLC测量上清液（胶束相）中6S含量，按式（3）计算生物可及性[24]：

式中：ρ为胶束层6S的质量浓度/（μg/mL）；V为胶束层的体积/mL；m为样品中6S的质量/μg。

1.3.7 细胞毒性实验

Caco-2细胞于添加体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养，细胞培养箱保持37 ℃和5%CO2（后同）。待细胞融合至80%～90%时，用胰酶消化细胞后，将细胞悬液以2×104个/孔的密度接种于96 孔板中过夜使细胞贴壁。弃去旧培养基，加入100 μL含相同6S质量浓度的游离6S（用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）预溶，DMSO体积分数＜0.1%）或ZCP-6S DMEM溶液，用不含6S的空白纳米颗粒（ZCP）表征载体材料的毒性。培养24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，再培养4 h，加入150 μL DMSO振摇1 min，用酶标仪测定490 nm波长处的吸光度，按式（4）计算细胞存活率：

式中：A1为加入样品细胞孔的吸光度；A2为未加样品细胞孔的吸光度。

1.3.8 细胞摄取实验

将细胞以每孔1.0×105个接种于6 孔板，置于CO2培养箱中培养，每隔1 d更换培养液，培养1 周后利用显微镜观察到Caco-2细胞融合至80%～90%时，可用于细胞吸收实验。利用HBSS缓冲液清洗细胞表面3 次，然后加入用HBSS缓冲液稀释的ZCP-6S及游离6S溶液，置于37 ℃恒温培养箱中培养1、2、4 h，然后加入预冷的HBSS缓冲液终止细胞吸收，用磷酸盐缓冲液清洗3 遍，利用细胞裂解液在冰上将细胞裂解30 min，然后利用超声处理，将细胞裂解液10 000 r/min离心2 min取上清液，利用液相色谱测定其中的6S含量。

1.3.9 细胞转运实验

将Caco-2细胞以每孔1.0×105个接种于6 孔Transwell板中，放于培养箱中培养，用电阻仪监测细胞的跨膜电阻值，同时通过显微镜观察细胞形态。第1周隔天更换培养液，1 周后每天更换培养液。培养至21 d后，将Caco-2细胞单层用HBSS液于37 ℃孵育30 min，再用HBSS液轻轻润洗3 次。上室加入1.5 mL HBSS稀释的ZCP-6S溶液和游离6S溶液作为供给液，下室加入2.5 mL空白HBSS作为接收液，在1、2、4 h 3 个时间点收集接收液，并补充等体积的HBSS，将收集液离心取上清液，利用液相色谱检测，计算下室接受液中6S的浓度为转运量。

1.3.10 大鼠口服生物利用度

本研究的动物实验方案经河北农业大学动物伦理委员会批准（审批号：2022010）。SD大鼠购买后在动物房适应性喂养1 周，可自由获得食物和水。实验前禁食12 h，不禁水。将12 只大鼠随机分为两组，灌胃6S混悬液或ZCP-6S溶液，6S剂量为100 mg/kgmb。分别在灌胃后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12 h从大鼠眼眶静脉采集血液约600 μL于抗凝离心管中，4 ℃、3 500 r/min离心10 min获得上层血浆，置于-80 ℃冰箱保存备用。使用辣椒素作为内标物，使用液-液萃取法对血浆进行前处理[25]。取大鼠血浆200 μL与内标辣椒素20 μL混合后加入800 μL乙酸乙酯，涡旋振荡2 min后10 000 r/min离心10 min获取上清液，将上清液转移至干净的离心管中，氮气吹干后用100 μL甲醇复溶，将10 000 r/min离心10 min的上清液置于液相瓶的内衬管中进行检测。使用DAS软件对各个时间点的6S血药质量浓度进行计算，拟合出6S原料药组与纳米颗粒组的各项药代动力学参数。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 粒径、电位和PDI

有研究表明，SC与玉米醇溶蛋白质量比为2∶1时纳米颗粒具有较小的粒径及较高的细胞摄取率[18]，因此本实验选择二者的比例为2∶1。颗粒大小是生物聚合物输送载体的一个关键特性，粒径越小其稳定性越强。由表1 可知，所有配方的颗粒粒径范围为（147.23±3.09）～（167.67±1.72）nm，与玉米醇溶蛋白纳米颗粒的典型粒径（100～400 nm）一致。所有配方纳米颗粒的PDI均小于0.15，表明粒径分布均匀。Zeta电位代表纳米颗粒的表面电荷，可以间接衡量颗粒溶液的稳定性，电位的绝对值越大颗粒溶液则越稳定。所有配方的纳米颗粒电位均为负值，表明玉米醇溶蛋白和SC之间存在静电吸引，带负电荷的SC包裹在带正电荷的玉米醇溶蛋白纳米颗粒表面使ZCP-6S带负电荷，Li Duoduo等[23]报道了类似的结果。本研究所有配方纳米颗粒的Zeta电位均在（-42.13±0.21）～（-23.80±0.31）mV之间，表明其稳定性较好。

表1 玉米醇溶蛋白与6S质量比对纳米颗粒的粒径、PDI和Zeta电位的影响Table 1 Effects of zein-to-6S ratio on particle size,PDI and zeta potential of nanoparticles

2.2 包埋率和固载率

包埋率和固载率是纳米颗粒作为药物或者营养物质运输载体的重要指标。如图1所示，纳米颗粒包埋率随6S比例增加呈先增后减的趋势，在玉米醇溶蛋白和6S质量比为2.5∶1时包埋率最高，为（83.08±5.81）%，当6S含量继续增大时包埋率有所降低，说明6S的添加量超出了纳米颗粒的包埋能力。而玉米醇溶蛋白比例越小，固载率就会越大，当玉米醇溶蛋白和6S质量比为2.5∶1时的固载率为（28.90±2.02）%。在其他封装不同活性物质的递送体系中也观察到类似结果[26]。根据以上结果，选择玉米醇溶蛋白和6S质量比2.5∶1进行后续实验，在该比例条件下，纳米颗粒的粒径较小、固载率较高、包埋率最高。

图1 玉米醇溶蛋白与6S的质量比对纳米颗粒包埋率和固载率的影响Fig.1 Effects of zein-to-6S ratio on encapsulation efficiency and loading efficiency of nanoparticles

2.3 TEM观察结果

如图2所示，纳米颗粒呈球形，大部分粒子直径在100～150 nm之间，也存在一些较小的颗粒。TEM观察到的粒径略小于纳米粒度仪测得的粒径（表1）。在一项关于果胶稳定玉米醇溶蛋白纳米颗粒的研究中也出现了类似的结果，这可能是由测试条件和原理差异引起，纳米粒度仪测量的是水合粒径，电镜观察的是干燥且去除水分后的颗粒粒径[17]。

图2 ZCP-6S的TEM图像Fig.2 TEM images of ZCP-6S

2.4 FT-IR分析结果

如图3所示，Z-SC1∶2的红外光谱在3 309、1 667 cm-1和1 535 cm-1处显示出典型的吸收峰，分别与O—H伸缩振动、酰胺I带和酰胺II带有关。酰胺I带由肽键中羰基伸缩振动造成，因为玉米醇溶蛋白具有α-螺旋结构。在形成纳米颗粒后，这些特征峰移动到了3 302、1 658 cm-1和1 532 cm-1处，说明玉米醇溶蛋白、SC、6S之间存在氢键和静电相互作用。在6S图谱中1 674 cm-1处产生的峰也是由羰基的伸缩振动产生。此外，6S、Z-SC1∶2、ZCP-6S分别在2 927、2 961 cm-1和2 958 cm-1处均存在C—H键的拉伸倾斜吸收峰。在800～1 600 cm-1之间有许多6S的连续特征吸收峰，对应6S结构中的苯环和—OH。然而，许多特征峰在形成纳米颗粒后都消失，如1 516、1 455 cm-1和1 274 cm-1处的特征峰，表明6S与蛋白质之间形成氢键或发生疏水相互作用，限制了其化学键的伸缩振动。综上可知，6S不是吸附在颗粒表面，而是通过非共价键相互作用力包封在纳米颗粒中。

图3 6S、Z-SC1∶2、ZCP-6S的红外光谱Fig.3 Infrared spectra of 6S,Z-SC1:2 and ZCP-6S

2.5 生物可及性

生物可及性是物质在消化过程中从食物基质中释放出来可以被小肠吸收的部分占摄入总量的比值[27]。如图4所示，6S封装在纳米颗粒中后，其生物可及性从（36.31±5.82）%提高至（75.34±9.82）%。6S在水中溶解性较差，在消化液中聚集沉淀，限制了胶束化的形成，导致生物可及性较低，而纳米颗粒能很好地溶解在消化液中。并且玉米醇溶蛋白在消化后被分解为两亲性多肽，与6S自组装形成胶束，有利于6S的溶解，进而提高了6S的生物可及性，此结果与Li Duoduo等[23]的研究结果一致。而利用pH值驱动法制备的玉米醇溶蛋白纳米颗粒中姜黄素的释放率在90%以上[28]。造成这些结果不同的原因，除了涂层材料的特性不同外，还与体外消化模型和纳米颗粒制备方法的差异有关。

图4 6S和ZCP-6S的生物可及性Fig.4 Bioaccessibilities of 6S and ZCP-6S

2.6 细胞毒性实验结果

如图5所示，ZCP在6S不同质量浓度下均没有表现出细胞毒性，细胞存活率均大于80%，表明载体材料本身生物相容性良好。在2.5～10 μg/mL范围内，游离6S和ZCP-6S的细胞存活率均高于80%，表明在这些浓度下两者都表现出无细胞毒性。但是当6S的质量浓度增加到20 μg/mL时，ZCP-6S的细胞存活率降为（66.49±2.33）%。因此选择6S质量浓度为10 μg/mL进行后续实验。研究表明6S能够显著抑制结肠癌细胞Caco-2和HCT116的迁移和增殖，并促进细胞凋亡[29]。ZCP-6S的细胞毒性作用增加，可能是由于纳米颗粒使6S能更好地被Caco-2细胞摄取。Xue Jinli等[30]的研究中也出现了类似现象，与游离姜黄素相比，姜黄素纳米颗粒对Caco-2细胞具有更强的抑制增殖作用，被包埋的姜黄素通过内吞作用的细胞内化可能是纳米颗粒细胞毒性增加的原因。

图5 用6S、ZCP和ZCP-6S处理后的Caco-2细胞存活率Fig.5 Cell viability of Caco-2 cell safter treatment with 6S,ZCP or ZCP-6S

2.7 细胞摄取实验结果

如图6所示，6S的摄取量随时间的延长而增加，并且ZCP-6S的摄取量在每一个时间点都显著高于游离的6S。处理4 h后，ZCP-6S的摄取量为（0.89±0.09）μg/mg，6S的摄取量为（0.53±0.04）μg/mg，细胞摄取量增加了（0.36±0.06）μg/mg，这表明包封在纳米颗粒中的6S能更有效地被Caco-2细胞吸收。纳米颗粒的摄取量取决于颗粒的粒径、电荷和界面特性等性质，粒径在100～200 nm之间的纳米颗粒具有最佳的Caco-2细胞摄取特性[31]。有研究表明，玉米醇溶蛋白中的某些肽可以通过激活肠上皮细胞的摄取机制提高Caco-2细胞对血红素铁的摄取[32]。而SC吸附在玉米醇溶蛋白纳米颗粒的表面可以降低界面张力，从而改善玉米醇溶蛋白纳米颗粒与细胞膜之间的相互作用。

图6 Caco-2细胞在1、2、4 h分别对ZCP-6S和6S的摄取情况Fig.6 Uptake of ZCP-6S and 6S by Caco-2 cells at 1,2 and 4 h

2.8 细胞转运实验结果

用Caco-2细胞单层模型模拟人小肠上皮细胞的吸收情况。电阻是评价细胞转运模型是否构建成功的重要指标。如图7所示，本实验建立的Caco-2细胞单层模型在培养21 d后电阻达到475 Ω·cm2，说明模型完整性较好，可以进行细胞转运实验。从图8可以看出，ZCP-6S在4 h内的跨膜转运能力显著优于6S，二者的跨膜转运量均表现出时间依赖性。在4 h时，6S的跨膜转运量为（1.20±0.09）μg/mL，ZCP-6S的跨膜转运量达到（2.26±0.04）μg/mL，增加了（1.06±0.06）μg/mL。这一结果表明，使用纳米颗粒作为载体可以提高6S在肠道的吸收。这是由于6S溶解度较低，限制了6S在Caco-2细胞中的吸收和转运，而包封于纳米颗粒中6S的溶解度有所提升。此外，纳米颗粒较小的粒径也有利于促进细胞的吸收和转运[33]。ZCP-6S的细胞摄取量和跨膜转运能力均高于6S，这也解释了其对Caco-2细胞具有更强的抑制作用。

图7 Caco-2细胞生长不同时间的跨膜电阻Fig.7 Transmembrane resistance of Caco-2 cells at different growth times

图8 不同时间游离6S和ZCP-6S通过Caco-2细胞单层模型的6S质量浓度Fig.8 6S Concentrations of free 6S and ZCP-6S through Caco-2 cell monolayers at different times

2.9 药代动力学分析

血药质量浓度-时间曲线如图9所示，主要的药代动力学参数见表2。二者的血药质量浓度均呈现先上升后下降的趋势，最终趋近于0 μg/mL。与6S相比，ZCP-6S的主要药代动力学参数得到显著改善。ZCP-6S的药峰质量浓度（ρmax）为（4.94±0.49）μg/mL，是6Sρmax的2 倍。与6S相比，ZCP-6S的AUC提高了2.28 倍，说明ZCP-6S的口服生物利用度显著提高。ZCP-6S的半衰期（T1/2）和平均驻留时间（mean retention time，MRT）分别是6S的1.71 倍和1.55 倍，表明纳米颗粒可以起到缓释作用，降低了6S在体内的消除速度。研究表明，玉米醇溶蛋白纳米颗粒可以改善二氢杨梅素在胃肠道中的黏附性，并使其在大鼠体内的口服生物利用度提高了1.95 倍[15]。玉米醇溶蛋白纳米颗粒本身具有黏附性，其外层稳定剂如SC、壳聚糖可进一步增强其黏附性，使其能够更好地吸附在肠上皮细胞上[34]。这种吸附作用可以延长6S在体内的停留时间，从而增加其在体内的积累量。综上，纳米颗粒可以有效地提高6S的口服生物利用度。

图9 口服6S和ZCP-6S后血药质量浓度-时间曲线Fig.9 Plasma concentration-time curves after oral administration of 6S and ZCP-6S

表2 口服6S和ZCP-6S后的主要药代动力学参数Table 2 Major pharmacokinetic parameters after oral administration of 6S and ZCP-6S

3 结论

通过反溶剂法成功制备了ZCP-6S，颗粒为球形，分布均匀，在6S、玉米醇溶蛋白、SC质量比为1∶2.5∶5条件下其包埋率和固载率最高，为（83.08±5.81）%和（28.90±2.02）%。氢键、静电和疏水相互作用是形成纳米颗粒的主要驱动力。体外模拟消化结果表明，纳米颗粒提高了6S在模拟胃肠液中的溶解度，使其生物可及性从（36.31±5.82）%提高至（75.34±9.82）%。纳米颗粒包埋的6S与游离的6S相比，更容易被Caco-2细胞吸收，4 h内通过Caco-2细胞单层模型的质量浓度也由（1.20±0.09）μg/mL增加至（2.26±0.04）μg/mL。口服给药后，6S的AUC提高了2.28 倍，T1/2为原来的1.71 倍。综上，玉米醇溶蛋白基纳米颗粒可以作为6S有效的输送载体，提高其生物利用度，本实验可为更好地发挥6S功能活性提供新思路。