脉通君安汤治疗气虚血瘀型冠心病心绞痛的临床疗效及转录组学研究

王子杨,刘美志,胡晓贞,周苗,翁嘉灏,赖志昆,孙永宁

(上海中医药大学附属市中医医院,上海 200071)

冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病,Coronary heart disease, CHD)是全球发病率和死亡率最高的心血管疾病之一[1],在中国,冠心病的发病率与死亡率也呈上升态势[2],严重危害人类生命健康,给患者和社会造成沉重的经济负担。心绞痛是由于暂时性心肌缺血引起的以胸痛为主要特征的临床综合征,是冠心病的最常见表现。目前对于冠心病的治疗手段主要包括以抗血小板、调脂稳斑等为主的药物保守治疗和以经皮冠状动脉支架植入术(Percutaneous coronary intervention, PCI)为主的介入治疗。冠心病心绞痛属于中医学“胸痹”“心痛”等范畴,中医药在对该病的治疗中积累了大量经验,能够一定程度上改善冠心病患者的临床症状及长期预后,但具体作用靶点或干预途径尚不明确。转录组学能够从整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律,目前已在中医药对疾病相关基因表达的影响、中医证候、中药有效成分的生物合成机制等现代中医药研究领域中被广泛应用[3]。

脉通君安汤是孙永宁教授的经验方,由经典名方补阳还五汤加瓜蒌子、瓜蒌皮、党参、白术组成,具有补气活血、化瘀通络之功效,对气虚血瘀型冠心病心绞痛患者疗效确切,但尚未被临床随机对照研究所证实。故本研究通过观察脉通君安汤治疗气虚血瘀型冠心病心绞痛的疗效,并对患者治疗前后的外周血样本进行转录组测序,旨在初步探索脉通君安汤潜在的作用靶点,为其临床应用提供科学依据。

1 临床资料

1.1 一般资料

选取2023年2—12月在上海市中医医院心病科就诊的140例气虚血瘀型冠心病心绞痛患者,按照随机数字表法分为治疗组和对照组各70例,其中对照组脱落3例。2组患者性别、年龄、病程、合并症及加拿大心血管学会(Canadian cardiovascular society, CCS)心绞痛分级等一般资料比较无统计学差异(P>0.05),具有可比性,见表1。本研究通过上海市中医医院伦理委员会审核通过(伦理批号:2023SHL-KY-23-01)。

表1 2组患者基线资料比较Table 1 Comparison of baseline information between 2 groups of

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准 参照2018年中华医学会《稳定性冠心病诊断与治疗指南》[5]及2007年《慢性稳定性心绞痛诊断与治疗指南》[6]中冠心病心绞痛诊断标准制定:有明确的陈旧性心肌梗死病史;冠脉造影提示至少1支冠脉狭窄,且管腔狭窄≥50%;冠状动脉CT血管成像提示主要血管管腔狭窄≥50%(或中度以上狭窄);心绞痛发作的程度、频度、性质及诱发因素在数周内无明显变化。

1.2.2 中医辨证标准 参照 2002 年《中药新药临床研究指导原则》[7]中冠心病证候诊断标准,并通过2名高级职称的中医医师联合判定。主症:胸痛,胸闷;次症:心悸,气短,神疲乏力,面色紫暗;舌脉:舌淡紫,脉弱而涩。符合主症1项加次症2项,结合舌脉即可辨证为气虚血瘀型。

1.3 纳入、排除及脱落标准

1.3.1 纳入标准 ①年龄在40～75岁;②符合冠心病心绞痛诊断标准及中医气虚血瘀证辨证标准;③CCS心绞痛分级Ⅱ～Ⅳ级;④自愿签署知情同意书。

1.3.2 排除标准 ①左冠状动脉主干狭窄;②未控制的高血压或经降压药物控制后收缩压≥160 mmHg和/或舒张压≥100 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa) ;③未控制的快速型心律失常、高度或完全房室传导阻滞或有症状的重度主动脉瓣狭窄、失代偿心力衰竭、急性肺栓塞、深静脉血栓、急性心包炎或心肌炎、急性主动脉夹层;④慢性肺病伴有呼吸困难症状;⑤近期卒中或短暂性缺血发作,有认知功能障碍;⑥尚未纠正的临床问题,如感染、严重贫血、电解质紊乱、甲状腺功能亢进等;⑦肝肾功能异常者(谷丙转氨酶或肌酐>2倍正常参考值上限);⑧过敏体质及对多种药物过敏者。

1.3.3 脱落标准 ①纳入后资料不完善者;②主动退出试验及失访者。

2 方法

2.1 治疗方法

对照组:予CHD二级预防西医基础治疗[8],包括抗血小板药:阿司匹林肠溶片(Bayer Vital GmbH,批号:BJ77230)100 mg·d-1;硫酸氢氯吡格雷片(深圳信立泰药业股份有限公司,批号:B230910)75 mg·d-1;调脂药:阿托伐他汀钙片(Godecke GmbH,批号:KC1H4012)20 mg·d-1、瑞舒伐他汀钙片(浙江京新药业股份有限公司,批号:505779)5 mg·d-1;血管紧张素转化酶抑制剂:马来酸依那普利片(河南灵广制药有限公司,批号:23112512)5 mg·d-1;血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂:厄贝沙坦片(浙江华海药业股份有限公司,批号:0000074129)150 mg·d-1、β受体阻滞剂:琥珀酸美托洛尔缓释片(阿斯利康制药有限公司,批号:2308127)47.5 mg·d-1,口服。

治疗组:在对照组治疗基础上加服脉通君安汤,组成:黄芪60 g(批号:20231008-2),当归6 g(批号:20230819-1),党参12 g(批号:20230907-1),炒白术9 g(批号:20230920-1),炒瓜蒌子6 g(批号:20230823-1),炒瓜蒌皮6 g(批号:20230830-1),桃仁6 g(批号:20230913-1),红花3 g(批号:20230728-1),川芎6 g(批号:20230810-1),赤芍6 g(批号:20230908-1),地龙6 g(批号:20230901-2),甘草3 g(批号:20230729-2)。饮片均购自上海万仕诚药业有限公司,由上海市中医医院中药房统一提供并煎煮,每日1剂,每袋100 mL,早晚各口服1袋。

2组疗程均为8周。

2.2 观察指标及方法

2.2.1 中医证候积分 治疗前后评估2组患者中医证候积分,主症按轻、中、重分别计2、4、6分,次症按轻、中、重分别计1、2、3分。积分越高,表示患者症状越严重。

2.2.2 临床疗效评价 参照CCS心绞痛分级标准进行判定,显效:心绞痛的症状得到有效缓解或者心绞痛评级提高至少2级;有效:心绞痛评级改善了1级,但未达到2级;无效:心绞痛分级没有好转;加重:心绞痛分级恶化 1 级或 1 级以上。总改善率=(显效例数+有效例数)/总例数×100%。

2.2.3 西雅图心绞痛量表(Seattle angina questionnaire, SAQ)评分 治疗前后比较2组患者SAQ量表各维度积分变化[8],该量表有19个条目共5个维度,包括躯体活动受限程度(Physical limitation, PL)、心绞痛发作情况(Anginal frequency, AF)、心绞痛稳定状态(Angina stability, AS)、治疗满意程度(Treatment satisfaction, TS)、疾病认知程度(Disease perception, DP)。每个条目按严重程度分别计1～6分,然后分别对5个维度中的条目得分相加,并对评分进行正向化处理,标准评分=(实际得分-维度最低分)/(维度最高分-维度最低分)×100%。每个维度满分均为100分,评分越高,表示患者生活质量及机体功能状态越好。

2.2.4 焦虑自评量表(Self-rating anxiety scale, SAS)、抑郁自评量表(Self-rating depression scale,SDS) 治疗前后比较2组患者SAS、SDS评分变化。SAS共20条目,每个条目按症状出现的频度评分,以“没有或很少时间、小部分时间、相当多时间、绝大部分或全部时间”分别计1～4分;SDS共20条目,以“没有或偶尔、有时、经常、总是如此”分别计1～4分。标准评分=各项评分之和×1.25。评分越高,表示患者症状越严重。

2.2.5 安全性指标 治疗前后检测患者血常规、尿常规、粪便常规及肝肾功能,监测心电图,观察不良反应的发生情况。

2.2.6 转录组测序及数据分析

2.2.6.1 外周血样本采集 治疗前后采用规范的静脉穿刺技术收集患者空腹外周静脉血2.5 mL至BD PAXgene全血RNA采集管(PAXgene采血管)中,采血结束后轻轻上下颠倒8～10次,以确保静脉血与PAXgene采血管内RNA稳定剂充分混匀,采取梯度降温方式保存,将PAXgene采血管静置于18～25 °C环境中保存4 h后置于-20°C的冰箱保存24 h以上,最后保存于-80°C冰箱中备用。

2.2.6.2 总RNA抽提与纯度检测 采用RNeasy mini kit RNA试剂盒(德国Qiagen公司,货号:74104)纯化自动化分离提取临床样本外周血总RNA。外周血RNA提取和纯化的具体步骤按照标准化流程进行。使用Qubit®3.0荧光计和Nanodrop One分光光度计测定RNA浓度和质量。使用Agilent Technogies 2100生物分析仪评估总RNA的完整性,并采用RNA完整性数(RIN)值>7.0的样品进行测序。

2.2.6.3 转录组测序及数据分析 使用illumina的ABclonal Whole RNA-seq Lib Prep kit构建RNA-seq链特异性文库。去除rRNA后,通过磁珠纯化RNA。然后在94 ℃下使用二价阳离子将RNA片段化为小块10 min。使用逆转录酶和随机引物将切割的RNA片段复制到第一链cDNA中。随后使用DNA聚合酶Ⅰ和核糖核酸酶 H(RNase H)进行第二链cDNA合成。然后,这些cDNA片段经历末端修复过程,添加单个“a”碱基和连接衔接子。通过PCR纯化并富集产物以产生最终的cDNA文库。通过Qubit®3.0荧光计和Agilent 2100生物分析仪对纯化的文库进行定量和验证,以确认插入物的大小并计算摩尔浓度。将文库稀释至10 pM后,由cBot生成簇,然后在Illumina NovaSeq 6000平台上测序。采用Qubit3.0对文库进行初步定量后采用Agilent 2100 生物分析仪检测文库大小范围,确认目的片段大小符合预期后,采用qPCR 法确定文库的有效浓度和定量。选用paired-end程序,进行双端(PE)测序。测序的过程完全由 Illumina提供的data collection software 进行控制,并实时对测序结果数据进行分析。使用fastp软件对序列进行过滤,得到clean reads后,再使用HISAT2软件(http://daehwankimlab.github.io/hisat2/)将clean reads与参考基因组进行比对。以上测序工作由上海鲸舟基因科技有限公司专业技术人员完成。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 2组患者治疗前后中医证候积分比较

结果见表2。

表2 2组患者治疗前后中医证候积分比较[M(P25,P75)]Table 2 Comparison of TCM syndrome points before and after treatment in 2 groups [M(P25,P75)]

3.2 2组患者治疗后CCS心绞痛分级比较

结果见表3。

表3 2组患者治疗后CCS心绞痛分级比较Table 3 Comparison of CCS angina grading between 2 groups of patients after treatment

3.3 2组患者治疗前后SAQ量表评分比较

结果见表4。

表4 2组患者治疗前后SAQ量表评分比较[M(P25,P75)]Table 4 Comparison of SAQ scale scores before and after treatment between 2 groups [M(P25,P75)]

3.4 2组患者治疗前后SAS、SDS评分比较

结果见表5。

表5 2组患者治疗前后SAS、SDS评分比较[M(P25,P75)]Table 5 Comparison of SAS and SDS scores between 2 groups before and after treatment [M(P25,P75)]

3.5 安全性指标

2组患者治疗后血常规、尿常规、粪便常规、肝肾功能等均未见明显异常改变。

3.6 转录组学结果

随机选取9例患者包括7名男性和2名女性,平均年龄(60.9±8.7)岁,平均病程(3.5±1.4)a,与治疗组患者总体情况基本匹配,治疗前后对其外周血样本进行转录组测序。结果表明脉通君安汤治疗前后有显著差异表达的mRNA共计862个,包括509个显著上调,353个显著下调(图1)。

图1 治疗前后差异表达的mRNA火山图Fig.1 Differential mRNA volcano plot before and after treatment

通过微生信平台(https://www.bioinformatics.com.cn/)对差异mRNA进行GO和KEGG富集分析,GO分析结果显示:差异表达mRNA的生物学过程(Biological process,BP)有666条,主要包括病毒基因表达、翻译启动、RNA分解代谢过程等(图2),细胞组分(Cell component,CC)112条,主要包括黏着斑、核糖体亚基、核斑点等(图3),分子功能(Molecular function,MF)有94条,主要包括双链RNA结合、钙黏蛋白结合、转录共调节因子活性等(图4)。KEGG分析结果显示:差异表达的mRNA富集信号通路包括20条,主要包括甘油磷脂代谢通路、单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信号通路、核糖体通路等(图5)。

图2 差异表达排名前10的mRNA BP弦图Fig. 2 Chord diagram of top ten BP in differential mRNA ranking

图3 差异表达排名前10的mRNA CC弦图Fig.3 Chord chart of top ten cellular components CC in differential mRNA ranking

图4 差异表达排名前10的mRNA MF弦图Fig.4 Chord diagram of top ten MF in differential mRNA ranking

图5 KEGG富集分析结果弦图Fig.5 Chord plot of KEGG enrichment analysis results

4 讨论

冠心病是最常见的心血管疾病之一,虽然现代医学有多种治疗手段,但冠心病的发病率和因病致死人数仍处在高水平[9]。冠心病常伴发焦虑、抑郁等心理疾患,在一定程度上影响疾病的治疗效果和康复进展。如何提高冠心病患者的生活质量和降低死亡率,改善远期预后一直是临床关注的热点。现代研究证实,中医药治疗在缓解心绞痛、预防PCI术后再狭窄、改善心力衰竭等许多方面有独到的临床优势[10]。转录组学是在整体水平上研究特定阶段或生理状态下某一细胞或组织所有基因转录情况及转录调控规律的一门学科[11],在一定程度上与中医的“证”的内涵相对应,近年来被广泛应用在中医药治疗疾病的机理探索方面[12]。

孙永宁教授师承首届国医大师张学文教授,认为冠心病的病因病机为外感风寒邪气,加之素体禀赋不足,或劳倦内伤,或饮食失节,而致心痹,心痹日久,气血虚耗,瘀血内阻,顽者夹杂痰湿内毒,而使心痹愈难治也,其发病以虚、瘀、痰、毒为主要病理因素,以补虚、活血、化痰、解毒为主要治法[13]。有研究纳入232篇文献共计29 257例冠心病患者发现,我国冠心病最常见的中医证型为气虚血瘀证[14]。另有1项检索1999—2013年冠心病中医辨证相关文献的研究,纳入87篇文献,涉及6 155名患者,结果显示排名前3位的证型为气虚血瘀证、心血瘀阻证和痰阻心脉证[15]。故而孙教授根据冠心病气虚血瘀证的核心病机,认为治疗当以补气活血为主,尤其重在补气,气足则血脉通畅。并自拟脉通君安汤,方中重用黄芪补益元气,意在使气旺则血行,瘀去则络通,当归活血通络而不伤血,与黄芪相配,共为君药;党参善补中焦之气,养血生津,瓜蒌子、瓜蒌皮理气宽胸,通阳泄浊,补气兼行气,川芎为“血中气药”,可行气活血解郁,赤芍凉血散瘀,共为臣药;白术健脾燥湿,加强益气助运之力,桃仁、红花、地龙通经活络,力专善走,周行全身以行药力,共为佐助;甘草调和诸药,为使药。现代药理学研究表明脉通君安汤中多种药物成分具有改善心肌缺血、降低细胞损伤等作用,其中黄芪多糖可以通过调节AMPK/mTOR通路来改善阿霉素诱导的心脏毒性[16],黄芪甲苷可以通过调节磷脂代谢和清除ROS来减轻氧化应激引起的心肌缺血再灌注损伤[17]。当归具有抗氧化、抗炎和抑制血小板聚集等作用[18],可以通过磷酸化p38 MAPK和90 kDa核糖体S6激酶(p-p90RSK)等减少海马缺血再灌注损伤[19]。川芎内酯可以通过LKB12-AMPK-mTOR信号通路保护PC1细胞免受氧-葡萄糖剥夺/再氧诱导的细胞凋亡[20]。瓜蒌皮具有保护缺血心肌、抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集等作用[21]。桃仁-红花是常用活血化瘀药对,其治疗冠心病机制可能与包括肿瘤坏死因子信号通路在内的多条炎症通路相关[22]。本研究结果表明,脉通君安汤联合CHD二级预防西医基础治疗能够改善冠心病心绞痛患者症状,降低CCS心绞痛分级及SAS、SDS评分,提高SAQ评分,具有较好的临床疗效,能显著提高患者的生活质量及机体功能,改善焦虑、抑郁等负性心理情绪。

本研究转录组学结果表明,脉通君安汤治疗冠心病的药理学机制是多靶点多通路的联合作用,主要涉及甘油磷脂代谢通路、AMPK信号通路、核糖体通路等,这些信号通路与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。

由甘油构成的磷脂称为甘油磷脂,是生物膜的主要构成成分,也是胆汁和膜表面活性物质的主要成分,参与细胞膜对蛋白质的识别和信号传导,其主要包括磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油等。膳食磷脂酰胆碱中胆碱部分的肠道微生物代谢与冠状动脉疾病之间存在机制联系,并通过产生三甲胺-N-氧化物导致动脉粥样硬化,从而提高患者的心血管风险[23]。磷脂酰丝氨酸介导的凋亡小体识别可激活特定的膜启动信号,进一步将磷脂酰丝氨酸与胆固醇代谢和脂质稳态联系起来[24-25]。磷脂酰丝氨酸膜受体、脑特异性血管生成抑制剂1(Brain-specific angiogenesis inhibitor 1,BAI1)对凋亡细胞的磷脂酰丝氨酸依赖性识别,开启膜启动途径,使ATP结合盒转运蛋白A1(Recombinant ATP binding cassette transporter A1, ABCA1)快速上调,将多余的胆固醇排出细胞外,从而产生抗炎作用,减轻动脉粥样硬化。此外,磷脂酰丝氨酸富含小而致密的高密度脂蛋白颗粒,也具有抗动脉粥样硬化作用[26]。核糖体是在各类细胞中普遍存在的颗粒状结构,是一种非常重要的细胞器,其功能是合成蛋白质[27]。核糖体合成蛋白1(Ribosome biogenesis protein 1,BOP1)和Pescadillo同源物1(Pescadillo homolog 1,PES1)在动脉粥样硬化患者中表达增加,并且二者均能够通过促进rRNA前体的剪接和核糖体生物合成来促进rRNA成熟,从而导致核糖体生物发生的过度激活,并最终导致人主动脉平滑肌细胞异常增殖和动脉粥样硬化[28-29]。核糖体生物发生始于核仁,受到包括核仁素(Nucleolin,Ncl)在内的300多种非核糖体因子调节rRNA前体转录和核糖体组装[30]。Ncl的异常定位参与多种病理过程,有研究表明,Ncl 表达异常与多种心血管疾病的发生有关,包括心肌梗死[31]、心力衰竭[32]和动脉粥样硬化[33]等。AMPK是一种广泛表达于多种组织和器官的代谢和氧化还原状态传感器。AMPK的细胞信号通路参与多种生理过程,如代谢、细胞骨架构建、转录控制、细胞凋亡和自噬[34],AMPK激活减少巨噬细胞中促炎细胞因子的释放,包括白细胞介素1β(Interleukin 1β, IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)等,同时增加巨噬细胞中抗炎细胞因子IL-10的表达[35]。激活的AMPK主要通过自噬调节平滑肌收缩和迁移,从而发挥抗动脉粥样硬化作用[36]。脉通君安汤可能主要通过调节上述信号通路,从甘油磷脂代谢、核糖体代谢及AMPK相关炎症信号途径方面对冠心病起到治疗作用。

综上所述,通过临床及转录组学研究发现,脉通君安汤对气虚血瘀型冠心病心绞痛具有较好的临床疗效和安全性,并通过多成分、多靶点、多途径来协同发挥防治冠心病的作用。但是本研究同时存在样本量较少、对转录组学的关键基因未进行验证等不足,后续将继续开展多中心、大样本量随机对照临床研究,对关键mRNA表达水平进行qPCR检测,并在动物与细胞实验中对此次筛选出的关键靶点及信号通路进一步验证,为脉通君安汤治疗气虚血瘀型冠心病心绞痛的药理学研究和临床应用提供依据。