肌层浸润性膀胱癌中CD276的表达与临床病理特征和预后的相关性

杨维清 杨庞

膀胱癌(bladder cancer,BC)好发于老年患者,吸烟是导致BC 发病率增加最常见的原因。此外,吸烟程度可能与BC 的侵袭性有关,重度吸烟者更有可能患高级别肿瘤和肌层浸润性疾病[1]。侵犯膀胱逼尿肌的BC被称为肌层浸润性膀胱癌(muscleinvasive bladder cancer,MIBC),其具有更高的转移至淋巴结和其他器官的倾向,5 年生存率约为60%～70%[2]。MIBC约占BC新诊断病例的20%,尽管进行了根治性膀胱切除术和盆腔淋巴结清扫,约50%的患者最终会因为扩散的微转移而在远处发生疾病[2-3]。因此,找到合适而准确的MIBC的生物标志物将有助于改善MIBC患者的预后状况。

在调节T 细胞免疫反应方面很重要的B7 家族,因其对癌症有潜在的治疗作用而被重视。CD276作为B7家族的一员,作为T 细胞抑制剂可促进肿瘤的增殖和侵袭。在大多数正常组织中,CD276通常以相对低的水平表达。相反,在恶性肿瘤组织中,CD276 的表达水平上调。此外,CD276的高表达已被发现与癌症患者较差的预后相关,这类肿瘤研究包括乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食管癌等[4-5]。然而,CD276 在MIBC 中的临床意义和预后价值在很大程度上仍不清楚。因此,确定可靠的生物标志物对改善MIBC的预后至关重要。本研究旨在利用癌症基因组图谱(The Cancer Geno me Atlas,TCGA)数据库探索CD276表达在MIBC 中的临床意义和预后价值,来为临床判断MIBC 的生存预后提供一个可靠的分子标志物。同时我们还尝试使用基因集富集分析(Gene Set Enrich ment Analysis,GSEA)进一步评估参与MIBC 发病机制相关的CD276调控网络的生物途径。

对象与方法

一、数据收集

我们从TCGA 数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/repositor y)下载了412例MIBC患者的表达数据和mRNA 表达谱(其中包括19例正常样本)以及与生存时间有关的临床信息。我们使用箱式图来显示离散变量的表达差异。412 例患者的RNA-Seq基因表达HTSeq-计数数据被用于进一步分析研究。

二、基因富集分析

GSEA 是一种计算方法,用于检测先验定义的基因集是否在高表达组和低表达组之间有统计学意义[5]。表型标签为CD276-高和CD276-低。每次分析都要进行1 000次基因组排列组合。通常情况下P<0.05 和错误发现率(f alse discover y rate,FDR)<0.25的基因组被认为是富集基因。

三、统计学方法

使用t检验来分析CD276在正常组织和肿瘤组织中的差异表达。使用Logistic回归评价临床因素与CD276表达之间的相关性。采用单因素Cox回归确定MIBC患者总生存期相关的临床因素。采用多因素Cox分析探索CD276表达与其他临床特征(年龄、性别、分期、分级、TNM 分期)在患者预后中的作用。根据中位风险评分将CD276分为高表达和低表达。使用R 软件(v4.1.3)进行统计分析。

四、使用人类蛋白质图谱数据库进行验证

人类蛋白质图谱(http://www.pr oteinatlas.org/)是一种病理学工具,可提供各种人类蛋白的多种表达谱。因此,我们利用人类蛋白质图谱数据库的免疫组化数据比较了CD276在正常和MIBC 组织中的蛋白表达。

结 果

一、CD276表达与临床参数之间的相关性

通过分析CD276在正常组织和肿瘤组织之间的差异表达,我们发现肿瘤组织相比正常组织中CD276表达明显升高(P<0.001)。进一步研究来自TCGA 的412例MIBC患者的临床数据,包括患者的年龄、性别、临床分期、临床分级、TNM 分期、生存状态和生存时间,我们发现CD276表达与临床分期(P=0.022)、临床分级(P<0.001)、年龄(P=0.003)和N 分期(P=0.008)显著相关。

采用Logistic回归分析发现,CD276的高表达与不良预后临床病理变量有关,见表1。MIBC 中CD276的高表达与高临床分期(Ⅳ期与Ⅱ期,P=0.014)、高龄(≥65岁与<65岁,P=0.008)、高临床分级(高级别与低级别,P=0.002)显著相关。这些发现揭示了CD276高表达的患者比CD276低表达的患者疾病有进展到更晚期的趋势。

表1 CD276表达与临床病理特征的Logistic回归分析

为了进一步检测CD276蛋白的表达,我们从人类蛋白质图谱中检索了免疫组化染色数据。在正常膀胱组织中,尿路上皮细胞通常具有中度的CD276染色,然而,MIBC组织则具有较强的CD276染色,证实了肿瘤组织相比正常组织中CD276表达明显升高,见图1。

图1 使用人类蛋白质图谱数据库验证CD276在MIBC和正常组织中的蛋白表达

二、生存和多变量分析

如图2所示,CD276的高表达与总生存率低密切相关(P=0.008)。单变量分析表明,CD276高表达与总生存期差显著相关(HR:1.385;95%CI:1.046～1.836;P=0.023)。与不良生存相关的其他临床因素包括年龄、临床分期、T 分期和N 分期,见表2。将这些变量纳入多变量分析中。多变量Cox分析显示,CD276高表达仍然是MIBC 患者总生存期的独立风险因素(HR:1.371;95%CI:1.018～1.846,P=0.037),另外还包括年龄(HR:1.041;95%CI:1.021～1.060,P<0.001)和T 期(HR:1.410;95%CI:1.024～1.943,P=0.035),见表2和图3。

图2 TCGA 数据库中MIBC患者的CD276表达和总生存率

图3 多变量回归分析森林图

表2 CD276表达与MIBC患者总生存率关系的单变量和多变量回归分析

三、GSEA 富集确定与CD276相关的信号通路

为了筛选在MIBC 中差异激活的潜在信号通路,我们进行了GSEA 富集分析,分别比较了CD276在MIBC中高表达和低表达相关的数据集。根据其标准化富集评分确定了与肿瘤相关的最显著富集的信号通路。参与肿瘤相关通路、膀胱癌、细胞黏附分子(CA Ms)、细胞外基质(ECM)受体相互作用、Wnt信号通路、趋化因子信号通路以及MAPK信号通路相关的基因集与CD276高表达之间存在差异相关性。

讨 论

CD276在许多肿瘤中过度表达,并经常与不良预后相关[6-7]。CD276 是B7 家族中的一个独立于抗原的共刺激配体成员。在小鼠中,CD276与表达在骨髓细胞上的触发受体如转录本2(TLT-2)蛋白结合,调节T 细胞反应。CD276的表达升高会增强小鼠中TLT-2介导的CD8+细胞毒性T 淋巴细胞对肿瘤的反应[8]。在另一项研究中,CD276通过阻断CD4+Th1-的激活从而阻止了抗肿瘤反应的激活[9]。这些研究结果为揭示CD276与肿瘤进展之间的关系提供一定依据,或许可以成为抗肿瘤的新方向。然而,CD276表达作为MIBC 生物标志物的临床意义尚未得到充分研究。本研究中,对来自TCGA 的高通量RNA 测序数据进行生物信息学分析,发现与正常膀胱组织相比,MIBC 中CD276 表达明显增加,这与之前的研究结果一致[9]。CD276在MIBC样本中的表达水平明显高于正常组织。结合我们在CD276 中的研究,表明CD276 在组织中的高表达水平可能与肿瘤进展相关。

通过进一步分析,我们发现CD276表达也与肿瘤分级、临床分期、年龄和N 分期密切相关。先前的研究报道,CD276的高表达水平已被发现与癌症患者较差的预后相关,相关的肿瘤研究包括乳腺癌等[4-5],这与我们在MIBC患者中的结果一致。通过生存分析曲线发现,CD276高表达与MIBC 患者预后不良有关。TCGA 数据库的单因素和多因素Cox分析表明,CD276表达是MIBC 患者预后不良的潜在独立标志物。为了进一步评估CD276 在MIBC中的作用,我们使用TCGA 数据进行了GSEA 富集分析。GSEA 富集结果显示,CD276的高表达参与肿瘤相关通路、膀胱癌、CA Ms、ECM 受体相互作用、Wnt信号通路、趋化因子信号通路以及MAPK 信号通路。

CA Ms存在于所有细胞表面,在细胞-细胞和细胞-ECM 相互作用中发挥作用。钙黏蛋白、整合素、选择素和免疫球蛋白家族的成员构成了CA Ms的主要类别。CA Ms通过参与细胞和组织的构成、细胞内外之间的信号传导、组织的损伤修复和伤口的愈合,提供了细胞外基质和细胞骨架之间的机械联系外。一般情况下,它们参与组织细胞的生长、增殖、空间组织和迁移等过程,因此在正常生理生长发育中发挥作用。这些过程也发生在病理状态下,如伤口愈合、炎症和肿瘤形成,尤其是在肿瘤侵袭和转移过程中。在这些条件下,ECM 的各种成分发生改变,金属蛋白酶也发生改变,其参与基质重塑和其他过程,如生长因子的释放[10-11]。不同类型的CA Ms不对称地表达在内皮细胞的管腔和非管腔区,并在细胞迁移中发挥重要作用。除了在细胞-细胞或细胞-ECM 相互作用中的意义外,关于其参与血管生成和血管生成的体内外实验结果支持了新毛细血管的形成,同时还参与了血管和脉管生成,CA Ms可能是肿瘤血管生成的重要因素之一[12-13]。这说明CA Ms和ECM 与MIBC的浸润生长和转移有关。

免疫系统及其组分在抗肿瘤反应中起重要作用。在另一方面,其产生的一些细胞介质,如趋化因子,可导致肿瘤进展[14]。有证据表明趋化因子积极参与细胞间相互作用和肿瘤增殖、新生血管形成和肿瘤转移的调节,研究人员在MIBC 肿瘤组织中发现趋化因子可触发免疫细胞包括髓源性抑制细胞和调节性T 细胞的迁移和活化,从而有利于肿瘤的发生和进展[15]。这与本研究结果一致。

与Wnt信号通路相关的成分和靶点可能是调节各种癌症发生和进展的重要因素,由于DNA 突变或甲基化导致的Wnt信号通路异常调节能够诱导Wnt信号分子表达变化,这可能与MIBC的进展有关[16]。越来越多的证据验证了Wnt信号通路的异常激活在MIBC 病理过程中起着关键作用[17]。这些发现强调了Wnt信号通路的潜在价值,尤其是在MIBC的预后和治疗中。MAPK 信号通路基本上调节恶性肿瘤细胞表型的所有方面,包括增殖、存活、迁移和侵袭[18]。有关研究证据表明MAPK 信号通路在MIBC 发病机制中被激活,通过调节ERK1/2 MAPK 和p38 MAPK 的过度表达,来参与肿瘤细胞的增殖、周期调控和死亡[19]。说明MAPK 信号通路与MIBC的发病和进展密切相关,这同样与我们的研究结果相符。通过抑制MAPK信号通路中相关蛋白的表达,或许可以为MIBC 的治疗提供一种选择。另外,尽管本研究已经证明CD276高表达是MIBC 预后的潜在独立分子标志物,但本研究仍具有一定局限性。未来需要开展进一步的实验来验证CD276在MIBC 中表达的生物学意义。

综上所述,基于对TCGA 数据库的分析,我们提供的证据表明CD276的高表达与MIBC 的不良进展相关,可能是MIBC潜在的预后分子标志物。