奶酪中氨基甲酸乙酯含量GC-MS/MS检测预处理条件优化

梁建英，唐 烁*，刘丽君，谢瑞龙，高玉杰，胡 雪，李翠枝，吕志勇

（1.内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010110；2.国家市场监管重点实验室（乳及乳制品检测与监控技术），上海 200127）

氨基甲酸乙酯（ehthy carbamate，EC）属于食品发酵产生的副产物[1-2]，来源于食品的发酵过程，发酵食品中基本含有氰化物和氨基甲酰化合物，即尿素、氨基甲酰磷酸盐、瓜氨酸和氰化氢[3]。这些主要前体化合物在食品加工和储存过程中在一定条件下与发酵产生的乙醇发生醇解反应可导致氨基甲酸乙酯的形成[4-6]。动物研究表明，EC会导致包括肺、肝和血管在内的多个组织部位的肿瘤发病率增加。因此，2007年EC已被列入可能的致癌物质（2A组）[7-9]。

众所周知，在乳品企业中奶酪制品是企业的重要品类之一，近年来已成为乳品企业效益增长的主力军，奶酪行业目前正处于高速扩张时期，未来仍然会持续较高的景气度[10-11]，国内乳品企业都很重视奶酪市场。奶酪又名干酪，是一种发酵的牛奶制品，因此奶酪中氨基甲酸乙酯的风险防控对于乳品企业意义重大。

目前奶酪中氨基甲酸乙酯含量的检测尚未有国家标准，但已有一些文章对发酵乳中氨基甲酸乙酯的检测进行了报道[12-14]，如赵艳菊等[15]对发酵乳制品中氨基甲酸乙酯检测进行了研究，其采用的是气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪内标法，前处理用有机溶剂二氯甲烷直接提取后上机检测。袁小美等[16]对发酵乳中氨基甲酸乙酯检测进行了研究，采用气相色谱-质谱联用仪内标法，但其前处理为盐酸溶液沉淀去除蛋白，然后离心得到提取液，经固相萃取小柱净化后检测。可见，针对发酵乳品，多数检测方法采用的是气相色谱-质谱联用内标法[17-19]，但在验证中发现，对于稍微复杂的基质，因氨基甲酸乙酯分子质量小，该方法存在着基质干扰大[20-22]，无法定性的问题[23-24]。目前，针对奶酪基质中氨基甲酸乙酯检测报道甚少，鉴于此，本研究选取儿童奶酪棒为代表性基质，参考已有氨基甲酸乙酯含量检测的标准及文献方法，按照六西格玛的定义-测量-分析-改善-控制（Define-Measure-Analyze-Improve-Control，DMAIC）项目改善路线进行检测过程影响因子的分析，实验数据采用Mintab软件（16.1.0版）进行统计学分析，并对该检测方法进行方法学考察。采用气相色谱-三重四级杆串联质谱（gas chromatographytriple quadrupole tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）[25-26]、外标定量法建立了奶酪中氨基甲酸乙酯含量的测定方法，为企业奶酪高质量安全发展保驾护航。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

奶酪样品：内蒙古伊利实业集团股份有限公司。

乙腈（色谱纯）、正己烷（分析纯）、氨基甲酸乙酯标准品（纯度99.8%）：上海安谱实验科技股份有限公司；二氯甲烷（分析纯）：成都诺尔施科技有限责任公司；无水硫酸钠、甲醇（均为分析纯）：天津市光复科技发展有限公司；超纯去离子水：实验室自制。

1.2 仪器与设备

TQS9000气相色谱-三重四级杆串联质谱仪、Biofuge Stratos低温高速离心机：美国赛默飞世尔科技有限公司；ME204分析天平（感量为0.0001 g）：瑞士梅特勒托利多公司；TurboVapLV全自动氮吹仪：瑞典Biotage公司；KS501涡旋振荡器：德国IKA公司；碱性硅藻土固相萃取柱（2 g/10 mL）：上海安谱实验科技股份有限公司；TG-WAXMS聚乙二醇毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国赛默飞世尔科技有限公司；弗罗里硅土固相萃取柱（0.5 g/3 mL）：天津博纳艾杰尔科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品提取

准确称取1.0 g奶酪代表性试样，置于15 mL的塑料离心管中，然后加入2 mL纯水，1 mL乙腈，将其涡旋混匀。混合5 min后，于0 ℃、转速6 000 r/min条件下离心8 min，收集提取液，残渣再加入1 mL乙腈重复提取一次，合并两次提取液，待净化。

1.3.2 样品净化

将样品提取液全部加入碱性硅藻土固相萃取柱上，当样品溶液完全渗入柱中后，将其静置保持10 min。净化时，首先量取10 mL正己烷，用其淋洗上样后的固相萃取柱，量取20 mL二氯甲烷，用其洗脱萃取柱，将洗脱液全部收集，置于装有2 g无水硫酸钠的氮吹管中，洗脱液经脱水后，于30 ℃缓缓氮吹，直至管中液体约0.5 mL，然后加入甲醇至1 mL，混匀后上机测定。

1.3.3 标准工作溶液配制

加入特定体积的氨基甲酸乙酯标准中间液（500ng/mL），然后用甲醇稀释到1 mL，配制得到质量浓度分别为5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL的氨基甲酸乙酯标准工作溶液，供气相色谱-串联三重四级杆质谱仪测定。

1.3.4 气相色谱-三重四级杆串联质谱检测条件

气相色谱条件：TG-WAXMS聚乙二醇毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。升温程序：50 ℃下保持1 min；以8 ℃/min的速率升温至180 ℃；以10 ℃/min的速率升温至240 ℃，然后保持5 min。载气为高纯氦气（He），流速为1.0 mL/min，进样量为1 μL。进样方式为不分流进样。

2.2.2 混合对照品溶液 分别精密量取“2.2.1”项下单一对照品贮备液各适量，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，得含淫羊藿属苷A、朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、宝藿苷Ⅰ质量浓度分别为 19.50、28.20、50.50、66.90、89.60、160.00、26.80、27.24 µg/mL的混合对照品溶液。

质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源；电子能量70 eV；传输线温度250 ℃；离子源温度280 ℃。

采用选择反应监测（selective reaction monitoring，SRM）模式；氨基甲酸乙酯的碰撞电压、定性离子对、定量离子对和保留时间参见表1。

表1 氨基甲酸乙酯的保留时间及质谱参数Table 1 Retention time and mass spectral parameters of ethyl carbamate

氨基甲酸乙酯含量的计算公式如下：

式中：X为氨基甲酸乙酯含量，mg/kg；C为依据标准曲线测得的目标物质量浓度，ng/mL；V为样品溶液的定容体积，mL；m为试样质量，g；1 000为换算系数。

2 结果与分析

2.1 样品预处理条件的优化

2.1.1 不同提取溶剂的选择

基于氨基甲酸乙酯化合物极性较强，奶酪基质蛋白含量高的特点，本试验选用二氯甲烷[15]、乙腈、乙腈水溶液（乙腈与水体积比1∶2）[24]及乙酸铅溶液（质量浓度5 g/100 mL）[27]4种不同试剂进行提取效率对比实验。分别按照样品的提取及净化方法，添加氨基甲酸乙酯标准溶液（质量浓度为0.01 mg/kg），检测奶酪样品中氨基甲酸乙酯的回收率，每个条件进行6次平行实验，收集样品回收率数据，采用Mintab软件进行单因子方差分析，结果见图1。由图1可知，在95%的置信度下，4种不同提取试剂条件下氨基甲酸乙酯的回收率之间有显著差异（P＜0.05）。二氯甲烷提取条件下，氨基甲酸乙酯平均回收率为37.46%，标准差2.47%；乙腈提取条件下，氨基甲酸乙酯平均回收率为76.46%，标准差12.46%；乙腈水溶液提取条件下，氨基甲酸乙酯平均回收率为78.22%，标准差5.58%；乙酸铅提取条件下，氨基甲酸乙酯平均回收率为68.73%，标准差17.01%。可见，乙腈水溶液的回收率平均值最高且变异波动较小。因此，本研究中优选乙腈水溶液（乙腈与水体积比1∶2）作为提取溶剂。

图1 不同提取试剂条件下氨基甲酸乙酯回收率比较Fig. 1 Comparison of ethyl carbamate recovery rates with different extraction reagents

2.1.2 提取溶剂中乙腈水比例选择

通过上述不同提取试剂的优化对比得出乙腈水溶液为最佳的前处理提取试剂，其中乙腈可以沉淀蛋白，水溶液可以有效溶解奶酪中的氨基甲酸乙酯。为了得到最佳的乙腈和水的比例，借助Mintab软件进行正交试验设计，对试验测定的回收率数据进行分析。首先对提取试剂中乙腈用量和去离子水用量进行2因子2水平加中心点的正交试验验，即低水平（乙腈1.0 mL＋去离子水2.0 mL）、中心点（乙腈1.5 mL＋去离子水3.5 mL）、高水平（乙腈2.0 mL＋去离子水5.0 mL），对正交试验结果通过Mintab软件进行方差分析，结果显示P＜0.05，说明中心点显著，需要增加轴点进行响应曲面设计。在上述的2因子2水平加中心点试验的基础上增加了轴点（乙腈1.0 mL＋去离子水3.5 mL、乙腈2.0 mL＋去离子水3.5 mL、乙腈1.5 mL＋去离子水2.0 mL、乙腈1.5 mL+去离子水5.0 mL）实施响应曲面试验，对试验结果通过Mintab软件进行响应优化器分析，分析结果表明：回收率最大时提取溶剂比例为乙腈1 mL、去离子水2 mL。因此，提取试剂乙腈水比例的最优条件为乙腈1.0 mL＋去离子水2.0 mL。

2.1.3 固相萃取柱的选择

奶酪试样提取后，提取液需经固相萃取柱净化，从而将样品中的杂质干扰成分与目标物分离，选择弗罗里硅土固相萃取柱和碱性硅藻土固相萃取柱进行对比。分别按照样品的提取及净化方法，添加质量浓度为0.01 mg/kg的氨基甲酸乙酯标准溶液，测定化合物回收率，每个条件进行至少6次平行实验，数据通过Mintab软件进行回归分析，结果见图2。由图2可知，两种固相萃取柱条件下，回收率均在60%～120%，但是弗罗里硅土柱条件下回收率变异系数为32.1%，不满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》中变异系数≤15%的要求，而碱性硅藻土柱条件下变异系数为10.4%，满足要求。同时，经查阅文献，发现针对氨基甲酸乙酯，碱性硅藻土固相萃取柱具有吸附性强、高保留、易洗脱的特性[28]，与实验结论相符。因此，优选碱性硅藻土柱净化。

图2 两种固相萃取柱条件下氨基甲酸乙酯回收率比较Fig. 2 Comparison of ethyl carbamate recovery rates with two solid phase extraction columns

2.1.4 洗脱剂二氯甲烷用量的选择

奶酪试样提取后，提取液经碱性硅藻土固相萃取柱净化过程中，首先样品中的氨基甲酸乙酯被固相萃取小柱吸附；然后使用弱极性的正己烷溶剂淋洗小柱，可以很好的除去样品中含有的杂质，而目标物氨基甲酸乙酯保留在碱性硅藻土固相萃取小柱上；之后需用洗脱试剂二氯甲烷将目标物从固相萃取小柱解吸附，收集洗脱液，浓缩后上机测试。实验中对二氯甲烷的不同用量10 mL、15 mL、20 mL进行对比，按照相同的实验操作，添加质量浓度为0.01 mg/kg的氨基甲酸乙酯标准溶液，测定目标化合物回收率，每个条件进行6次平行实验，数据通过Mintab软件进行回归分析，结果见图3。由图3可知，洗脱剂二氯甲烷用量与目标化合物回收率呈现线性关系，随着洗脱试剂用量的增加，目标物回收率增大。结合实验成本、环境污染、绿色化学等因素，本研究优选洗脱剂二氯甲烷用量为20 mL。

图3 洗脱剂二氯甲烷用量对氨基甲酸乙酯回收率的影响Fig. 3 Effect of eluent dichloromethane addition on the recovery rates of ethyl carbamate

2.2 标准曲线回归方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限

本实验是外标方法定量，以氨基甲酸乙酯标准溶液的定量离子对峰面积（Y）为纵坐标，标准溶液质量浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线。实验结果表明：奶酪基质中氨基甲酸乙酯含量在5～200 ng/mL质量浓度范围内，标准曲线回归方程Y=2 012X-3 306、相关系数R2=0.998 9，＞0.99，线性相关满足检测要求。本研究奶酪基质中氨基甲酸乙酯含量的定量限是0.01 mg/kg，信噪比（signal to noise ratio，S/N）满足不小于10的要求，检出限是0.005 mg/kg，信噪比（S/N）满足不小于3的要求，方法灵敏度高。

2.3 方法回收率和精密度试验

本实验中选用空白儿童奶酪棒样品进行低水平（0.01 mg/kg）、中水平（0.02 mg/kg）、高水平（0.10 mg/kg）3个添加水平的加标回收率测定试验，每个添加水平进行6平行试验。回收率和精密度的测定结果见表2。由表2可知，加标回收率范围为69.1%～91.2%，精密度试验结果相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为4.2%～11.1%，结果满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》中方法回收率和精密度检测要求，适用于奶酪中氨基甲酸乙酯含量的测定。

表2 加标回收率和精密度试验结果（n=6）Table 2 Results of standard recovery rates and precision tests (n=6)

2.4 实际样品检测

随机的抽取5种奶酪产品进行检测，分别为双层奶酪棒（混合水果味）、可以吸的奶酪（草莓味）、芝士片（经典原味）、马苏里拉芝士碎、马苏里拉奶酪，按照方法操作步骤对上述产品进行氨基甲酸乙酯含量测试，检测结果显示未检出。

3 结论

参考现有食品安全国家标准中氨基甲酸乙酯含量的检测方法，本研究按照精益六西格玛DMAIC项目改善思路，挖掘出针对奶酪基质，影响其氨基甲酸乙酯含量检测结果准确性前处理过程提取试剂、固相萃取小柱、洗脱试剂用量等，并对这些因子进行了重点优化试验设计，试验数据采用Mintab软件进行统计学分析，最终建立了一种奶酪中氨基甲酸乙酯含量的气相色谱-三重四级杆串联质谱测定方法。该方法在5～200 ng/mL质量浓度范围内标准曲线线性相关，且相关系数＞0.99。方法定量限为0.01 mg/kg，检出限为0.005 mg/kg，在0.01～0.10 mg/kg含量范围的加标回收率试验中，样品回收率为69.1%～90.7%，精密度试验结果RSD为4.2%～11.1%。该方法操作简便，结果准确，可以为奶酪食品的质量安全提供保障。