高效液相色谱法检测白酒中痕量环己基氨基磺酸钠

魏 功，王 乐，李春芳，张智洋，任国军，严 伟，王 慧*

（内蒙古河套酒业集团股份有限公司，内蒙古 巴彦淖尔 015400）

环己基氨基磺酸钠，俗称甜蜜素，是一种使用较广泛的甜味剂，常被用于糕点、蜜饯、饮料等食品中[1]。在GB/T 15109—2021《国标白酒工业术语》[2]中的固态法、液态法和固液法白酒规定：“不直接或间接添加食用酒精及非自身发酵产生的呈色呈香呈味物质”，甜蜜素并非自身发酵产生，所以它不允许出现在浓香型白酒[3]、清香型白酒[4]以及其他香型白酒[5-6]中。近年来市售白酒中经常被爆出甜蜜素不合格[7-9]，中小型酿酒企业尤为严重[10]，基本上都是一些不法分子甚至技术人员为了改善白酒的口感，非法添加来弥补酒体自身多元醇含量的不足而欠缺的回甜感[11]。

目前甜蜜素常用的检测方法有气相色谱法[12-14]，适合检测饮料酒和配制酒，较高的检出限不适合检测白酒，而液相色谱法[15-17]和离子色谱法同样因检出限太高不能满足白酒检测要求[18-19]，以上仪器方法适合白酒中甜蜜素检测的文献非常鲜见。国家标准可用于检测白酒中甜蜜素的只有GB 5009.97—2016《食品安全国家标准食品中环己基氨基磺酸钠的测定》第三法[20]。闫吉昌等[21]对国标三种方法进行了改进研究，结论是第一法气相色谱法和第二法液相色谱法仅可用于配制酒检测。目前适用于白酒中甜蜜素检测的主要有液相色谱-串联质谱法[22-24]，还有白酒中多种甜味剂检测的串联质谱法[25-26]，这些方法均快速、准确、灵敏度高，但是仪器价格昂贵，运行和维护费用也非常高，一般的小型甚至中型酿酒企业的实验室都无法承受。因此有必要建立一种成本和运行维护费用低廉的方法，并且检出限能达到甚至超过国标液相色谱-质谱/质谱法，适合中小酒企实验室检测白酒中甜蜜素。该实验建立了一种利用高效液相色谱检测白酒中痕量环己基氨基磺酸钠（甜蜜素）的方法。根据甜蜜素的热稳定性对白酒样品进行第一次浓缩，衍生后不同萃取溶剂萃取、碱洗后进行二次浓缩，选择不同的溶剂复溶后过膜上机测试，通过流动相试验优化色谱条件，单因素试验、正交试验优化前处理条件，再通过方法学考察进行评价。旨在为其做好白酒生产过程中的甜蜜素风险控制提供技术支持，促进企业健康良性发展，保障食品安全。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

66.5%vol清香型原浆酒（2021年产）、67.8%vol浓香型原浆酒（2020年产）：内蒙古河套酒业集团股份有限公司；各类香型白酒：市售；环己基氨基磺酸钠（以环己基氨基磺酸计）标准溶液（1 000 μg/mL）：坛墨质检标准物质中心；甲醇、正庚烷、正己烷、环己烷、二氯甲烷、正戊烷、乙酸铵、乙腈（均为色谱纯）：上海安谱实验科技股份有限公司；硫酸、次氯酸钠、碳酸氢钠（均为分析纯）：天津科密欧化学试剂有限公司；0.22 μm尼龙针滤膜：日本岛津公司。

1.2 仪器与设备

TD20002A电子天平：天津天马衡基仪器有限公司；BSA224S-CW电子天平：德国赛多利斯公司；KQ-500DA数控超声波清洗机：昆山超声仪器有限公司；HX-6024电热恒温水浴锅：山东菏泽华兴仪器仪表有限公司；VORTEX-2涡旋混匀器：上海沪析实业有限公司；SD-12氮吹仪：上海净信实业发展有限公司；LC-20AD高效液相色谱仪（配备SPD-20A紫外检测器）：日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 基质标准溶液的配制

以酒精度、香型、成分与被测酒样接近的不含环己基氨基磺酸钠及其衍生物的白酒样品为基质，配制成环己基氨基磺酸钠（以环己基氨基磺酸计）系列标准溶液，质量浓度分别为1.00 mg/kg、0.50 mg/kg、0.10 mg/kg、0.05 mg/kg、0.03 mg/kg、0.01 mg/kg。

1.3.2 样品处理

初步浓缩：称取白酒样品于蒸发皿中，沸水浴加热蒸去挥发性物质，将蒸发皿底部固形物残渣用5 mL水超声2 min洗入25 mL比色管中，再用5 mL水润洗一遍，合并洗液。

衍生化：将上述试样溶液中加入1.0 mL硫酸溶液（1+1）、1.0 mL次氯酸钠溶液（有效氯50 g/L以上）、5.0 mL萃取溶剂，涡旋混匀器上涡旋2 min，静置分层后转移全部有机相至50 mL比色管中，加入25 mL碳酸氢钠溶液（50 g/L），振荡1 min。静置分层后转移全部有机相于10 mL比色管中。

二次浓缩：将上述比色管中的有机相在氮吹仪上50 ℃吹干，用1 mL溶剂复溶，经0.22 μm尼龙针滤膜过滤，滤液备进样用。

1.3.3 液相色谱条件

将0.03mg/kg的基质标准溶液通过样品处理的全部步骤处理上机，设置进样量：20 μL；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL/min；紫外检测器检测波长：314 nm，Pribolab MycoChrom C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）分离，考察3种流动相体系A：甲醇∶水（75∶25，V/V），B：乙腈∶水（70∶30，V/V），C：甲醇∶10 mmol/L乙酸铵水溶液（75∶25，V/V）对目标物质的色谱峰形态、基线噪声、分离效果等的影响。

1.3.4 定性定量方法

环己基氨基磺酸钠在硫酸提供的酸性环境下与次氯酸反应生成N,N-二氯环己胺和一些副产物，衍生物N,N-二氯环己胺经过液相色谱分析柱分离后，在波长314 nm处的紫外吸收峰面积与样品中的环己基氨基磺酸钠含量成正比，根据保留时间定性，外标法定量[12]。

1.3.5 样品前处理条件优化

（1）单因素试验设计

设置白酒样品环己基氨基磺酸钠（以环己基氨基磺酸计）添加水平为0.03 mg/kg，按照前述样品处理步骤和色谱条件，分别考察称样量、蒸干程度、萃取溶剂、复溶溶剂对结果的影响，以信噪比（signal to noise ratio，S/N）确定较优水平区间，单因素试验因素与水平见表1。

（2）正交试验设计

根据单因素试验的结果，选择称样量100 g，以蒸干程度（A）、萃取溶剂（B）、复溶溶剂（C）为考察因素，设计3因素3水平的正交试验，正交试验因素与水平见表2。

表2 前处理条件优化正交试验因素与水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for pretreatment condition optimization

1.3.6 线性关系、检出限、定量限

以基质白酒中环己基氨基磺酸钠质量浓度（X）为横坐标，经过前处理的目标物质N,N-二氯环己胺的峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线。在基质白酒中添加环己基氨基磺酸钠，以3倍信噪比（S/N=3）计算检出限，10倍信噪比（S/N=10）计算定量限。

2 结果与分析

2.1 流动相优化

3种流动相体系对目标物质的色谱峰形态、基线噪声、分离效果等的影响见图1。

图1 3种流动相体系的高效液相色谱图Fig. 1 High performance liquid chromatograms of three mobile phase systems

由图1可知，C流动相色谱峰形态较好，基线噪声低，分离效果佳，原因是流动相中的乙酸铵溶液提高了N,N-二氯环己胺的离子化效率，同时作为离子对试剂改善了目标物质在液相色谱上的保留行为[27]，因此选择甲醇∶10 mmol/L乙酸铵水溶液（75∶25，V/V）为最优流动相。

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 称样量对信噪比的影响

考察不同称样量对信噪比（S/N）的影响，结果见图2。

图2 称样量对信噪比的影响Fig. 2 Effect of sample weight on signal to noise ratio

由图2可知，随着称样量的增大，信噪比随之升高，称样量在30～50 g时，信噪比还不能满足检测要求，称样量在100 g时，信噪比已经超过3，采用3倍信噪比（S/N）计算检出限是0.03 mg/kg，已经可以达到国标GB 5009.97—2016《食品安全国家标准食品中环己基氨基磺酸钠的测定》第三法液相色谱-质谱/质谱法测定白酒中甜蜜素的水平。进一步考察加大称样量对检测图谱的影响，称样量达到120～150 g时，检测图谱基线噪声变大，因为基质干扰变得严重，结合试验过程中的蒸干浓缩耗时变长，部分样品衍生时泡沫增多、分层困难甚至乳化、有机相损失严重等，从而选择最佳称样量为100 g。

2.2.2 蒸干程度对信噪比的影响

考察不同蒸干程度对信噪比（S/N）的影响，结果见图3。

图3 蒸干程度对信噪比的影响Fig. 3 Effect of evaporation degree on signal to noise ratio

由图3结合试验过程可知，在沸水浴蒸至剩余约5 mL和1 mL时，信噪比较低，因为这里包含了较多的干扰物质，导致检测图谱噪声强度偏大。蒸干样品会使噪声强度减小，信噪比显著提升，续蒸0.5 h和1.0 h会使检测图谱噪声强度变得更小，同时衍生物N,N-二氯环己胺信号强度窄幅也减小，但是信噪比会稳定在较高水平，这是因为甜蜜素的热稳定性，蒸干到续蒸过程使白酒中造成紫外吸收信号干扰的部分物质和衍生前体物质挥发，甜蜜素保留，样品得到了很大程度的净化，因此选择蒸干以及干后续蒸0.5 h和1.0 h 3种蒸干程度进行正交试验。

2.2.3 萃取溶剂对信噪比的影响考察不同萃取溶剂对信噪比（S/N）的影响，结果见图4。

图4 萃取溶剂对信噪比的影响Fig. 4 Effect of extraction solvent on signal to noise ratio

由图4结合试验过程可知，正庚烷、正己烷、环己烷作为萃取溶剂时信噪比较高，说明它们对衍生物N,N-二氯环己胺有更好的提取效果，其次是正戊烷、二氯甲烷，相同浓度下信噪比越高代表着方法更低的检出限和定量限，更高的检测精度，因此选择提取效果较好的正庚烷、正己烷、环己烷进行正交试验。

2.2.4 复溶溶剂对信噪比的影响

考察不同复溶溶剂对信噪比（S/N）的影响，结果见图5。

图5 复溶溶剂对信噪比的影响Fig. 5 Effect of redissolved solvent on signal to noise ratio

由图5结合试验过程可知，流动相甲醇∶10 mmol/L乙酸铵水溶液（75∶25，V/V）和正庚烷、正己烷作为复溶溶剂时的图谱较好，信噪比较高，流动相复溶溶剂效应低，峰形态好，正庚烷和正己烷对目标物质溶解性优于流动相。甲醇和乙腈对目标物质溶解性相对较差，图谱信号强度低，信噪比低，综合考虑优选正庚烷、正己烷、流动相（甲醇∶10 mmol/L乙酸铵水溶液（75∶25，V/V））作为复溶溶剂进行正交试验。

2.3 正交试验结果与分析

根据单因素试验结果，以蒸干程度（A）、萃取溶剂（B）、复溶溶剂（C）为评价因素，以信噪比为评价指标，选取9份白酒加标样品（添加水平为0.03 mg/kg）进行3因素3水平正交试验，结果见表3。

表3 前处理条件优化正交试验结果与分析Table 3 Results and analysis of orthogonal test for pretreatment conditions optimization

由表3可知，3种因素对高效液相色谱检测白酒中环己基氨基磺酸钠图谱信噪比的影响的大小顺序为B＞A＞C，即萃取溶剂＞蒸干程度＞复溶溶剂；最优的前处理条件为A2B3C3，即沸水浴蒸干续蒸0.5 h、正庚烷萃取、流动相甲醇∶10 mmol/L乙酸铵水溶液（75∶25，V/V）复溶，以此条件对上述白酒加标样品进行试验，平均信噪比可以达到10.21，高于试验组6的S/N，且图谱噪声强度较低、干扰较少。

2.4 基质标准曲线线性关系、检出限、定量限

在正交试验得到的最佳条件下，对环己基氨基磺酸钠按照1.3.1的质量浓度为基质标准溶液处理后上机测试，以环己基氨基磺酸钠质量浓度（x）为横坐标、衍生物（N,N-二氯环己胺）峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程为y=93 287x-476.76，R2=0.999 8，说明该方法在0.01～1 mg/kg质量浓度范围内标准曲线线性关系良好。采用向空白样品中逐级降低添加浓度的方法确定方法的检出限和定量限，以3倍信噪比、10倍信噪比分别计算，最终得到方法检出限0.01 mg/kg，定量限0.03 mg/kg，优于白酒检测国标GB 5009.97—2016《食品安全国家标准食品中环己基氨基磺酸钠的测定》第三法液相色谱-质谱/质谱法的检出限0.03 mg/kg，定量限0.10 mg/kg。

2.5 精密度试验

采用最佳处理条件，对5种香型白酒中的甜蜜素添加样品分别进行6次平行测定，精密度考察结果见表4。

表4 不同香型白酒中甜蜜素含量测定的精密度试验结果Table 4 Precision test results of sodium cyclamate content in different flavor Baijiu

由表4可知，不同香型白酒样品中甜蜜素测定结果的6次平行试验结果相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为2.70%～3.73%（n=6），RSD均＜5%，结果表明本方法精密度良好，满足分析要求。

2.6 加标回收率试验

为了验证本方法检测结果的准确性，选择不同香型原酒和成品白酒进行加标测定，环己基氨基磺酸钠添加高、中、低3个水平分别为0.10 mg/kg、0.50 mg/kg、1.00 mg/kg，每个添加水平按照正交试验得到的最佳条件平行测定3次，计算加标回收率和相对标准偏差，结果见表5。

表5 不同香型白酒中甜蜜素的加标回收率试验结果Table 5 Test results of recovery rates of cyclamate in different flavor Baijiu

由表5可知，本方法在不同香型原酒和成品白酒样品的加标回收率在94.4%～103.7%，加标回收率试验结果的RSD为0.44%～1.96%，准确度较高。

2.7 白酒样品中环己基氨基磺酸钠的测定

使用该方法对市售的15个批次大、中、小白酒厂家样品进行甜蜜素检测，其中12个批次未检出，2个批次含量在0.01～0.03 mg/kg之间，1个批次含量为0.041 mg/kg，超过了国标GB 5009.97—2016《食品安全国家标准食品中环己基氨基磺酸钠的测定》第三法检出限0.03 mg/kg，可以视为检出，说明目前白酒行业仍然可能存在非法添加或库存酒残留甜蜜素的情况。

3 结论

本研究建立了一种高效液相色谱检测白酒中痕量环己基氨基磺酸钠的方法，最终确定了最佳前处理条件为称样量100 g、沸水浴蒸干续蒸0.5 h除去白酒中大部分干扰成分、衍生后正庚烷萃取、碱洗后二次浓缩、采用流动相复溶后上机选用甲醇∶10 mmol/L乙酸铵水溶液（75∶25，V/V）流动相检测。再通过线性范围、精密度、加标回收率对方法进行评价，该方法检出限为0.01 mg/kg，定量限为0.03 mg/kg，在各类原酒和成品白酒中的加标回收率都在94.4%～103.7%，准确度较高，精密度试验结果的相对标准偏差为2.70%～3.73%（n=6），精密度良好，本实验与白酒国标检测方法及已有的相关研究相比，检出限和定量限有了较大提升，优势明显，其次用到的仪器设备普及度高，运行和维护成本低，尤其适合不具备条件购买液相色谱-质谱/质谱的众多中小型酿酒企业对白酒中甜蜜素的风险控制。