β-石竹烯产生菌的筛选和提取工艺优化

牟飞燕，何夷敏，夏博宇，董孝元，陈 晖，常 煦，陈茂彬，方尚玲*

（1.湖北工业大学 生物工程与食品学院 工业发酵省部共建协同创新中心，湖北 武汉430068；2.黄鹤楼酒业有限有限公司，湖北 武汉430000；3.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌443000）

β-石竹烯（β-caryophyllene,BCP）属于双环倍半萜型化合物，该物质具有局部麻醉、消炎镇痛、抗癌、抗高血压、镇咳、治疗结肠炎及治疗帕金森症等药理作用，同时还具有净化空气的作用[1]。目前，BCP的研究主要围绕各类食用香精、重质松节油、积雪草、菊花、牛至精油等[2-4]，由于BCP不溶于水，易溶于醇类物质和醚类物质，所以在BCP提取物质选择上主要偏向于醇类和醚类物质，王芳等[2]对积雪草中BCP的提取主要采用的是石油醚（沸程30～60 ℃），刘东静等[5]对佩兰药材中石竹烯含量测定中亦采用了乙醇与石油醚进行提取，其中乙醇提取效果更佳。另外，随着BCP在生物医药、保健食品及生物燃料等领域的需求量增大，仅依靠植物提取和纯化的传统生产方法提取的BCP显然供不应求，目前，BCP在许多领域受到了广泛的关注和研究，但仍需要进一步深入的研究和开发，以更好地应用于相关领域中[3]。

白酒是我国传统饮料酒，工艺独特，风格突出，许多名酒在国内外享有盛名，其中清香型白酒作为我国浓、酱、清、兼四大香型白酒之一，其独特的花香与果香味受到广大消费者的欢迎[6]。“大曲”作为白酒发酵过程中的催化剂[7]，为白酒酿造提供了主要的功能微生物区系及其代谢物，包括水解酶、挥发物和半挥发物等，这些成分有助于白酒风味物质的产生[8]。白酒中的微量组分约占1%～2%，含量虽低，但其种类、组成与比例均对白酒的口感、风味和香气的形成具有重要影响，因此需对白酒中特征风味物质进行研究[9]。另外，由于微生物的生长代谢是产生风味物质最主要的来源，明晰白酒中相关微生物的作用及其与特征风味的关系对提升白酒品质具有重要意义[10]，但是目前对白酒和大曲中BCP及其来源研究甚少，已经报道了产BCP的真菌有黄曲霉[11]、青霉[12]等。这些真菌的分离筛选主要是通过采用传统的分离培养方法，如土壤分离、植物样品分离等，近年来关于中国白酒中萜烯类化合物的研究也越来越多，霉菌是酿制中国白酒的重要微生物之一，但目前仅有一篇相关专利表示大曲中的分支横梗霉（Lichtheimia ramosa）可在大曲的发酵过程中，通过代谢产生BCP，为大曲赋予了特殊的风味和香气。BCP产生真菌的分离筛选及其BCP的提取是一个复杂的过程，需要综合考虑多种因素[13]。产BCP的真菌筛选具有提高产量、优化生产工艺、提高品质和探索新资源的必要性，有助于推动BCP的产业化发展和应用推广[14]。

该研究通过顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction HS-SPME）-气相色谱-质谱联用（gas chromatography，GC-MS）法对清香型白酒和大曲中香气成分进行检测，采用传统分离技术对大曲中产β-石竹烯（BCP）菌株进行分离筛选，将初筛菌株进行麸皮发酵对产BCP菌株进行复筛后通过分子生物学技术对其进行鉴定，对麸曲中β-石竹烯通过气相色谱（GC）法进行提取条件优化，并将筛选菌株在小坛发酵中进行应用。为大曲酿造过程中芳香化合物的产生和调控提供了重要的理论基础和实践指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

清香型白酒及大曲来源于湖北某酒厂，贮藏于4℃冰箱。

1.1.2 试剂

BCP、双戊烯、十二烷、乙醇、石油醚（沸程在30～60 ℃）、NaCl：上海麦克林生化科技有限公司。所用试剂均为分析纯。

1.1.3 培养基

沙氏培养基（SDA）：葡萄糖40 g、蛋白胨10 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL，pH值自然。

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、水1 000 mL，pH值自然。

麸皮培养基：细麸皮100 g，蒸馏水70 mL（料水比为10∶7），pH值自然。

以上培养基均在121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

LDZX-50KBS高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；LRH-250生化培养箱：上海智城分析仪器有限公司；5977B-7890B气相色谱-质谱联用仪：美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 分析检测

（1）清香型白酒中香气成分

清香型白酒香气成分检测通过顶空固相微萃取-气相色谱联用（HS-SPME-GC-MS）法[15-17]。

HS-SPME条件：在顶空瓶中加入6 mL原酒样稀释至14%vol待测酒样，加入100μL混标（203mg/L叔戊醇、201mg/L乙酸正戊酯），同时加入3 g NaCl和白色磁力转子于60 ℃磁力搅拌加热台上加热45 min，转子转速为200 r/min，然后将已老化过的萃取头插入样品瓶的顶空部分，萃取过程为40 min，之后将萃取头插入气相色谱的进样口250 ℃解吸5 min。

GC条件：进样口温度250 ℃；升温程序为初始温度40 ℃保持2 min，5 ℃/min升至145 ℃，再以20 ℃/min升温至260 ℃；维持5 min；载气为高纯度氦气（He），载气流速1 mL/min。MS条件：电子电离（electron ionization，EI）源，离子源温度为210 ℃，电离电压70 eV，接口温度为250 ℃，四极杆温度：150 ℃；质量扫描范围：50～550 m/z。

定性、定量分析：通过美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology,NIST）各挥发性风味物质的保留时间对白酒中挥发性香气物质进行定性分析，并通过内标法进行定量分析。

（2）清香大曲中香气成分

清香大曲中香气成分检测通过顶空固相微萃取-气相色谱联用（HS-SPME-GC-MS）法。

GC条件：升温程序起始温度40℃，维持5min，以5℃/min升温至220 ℃，维持5 min；气化室温度为250 ℃；分流比为10∶1，载气为高纯度氦气，流速为1 mL/min。MS条件：电子电离（electron ionization，EI）源，离子源温度为210 ℃，电离电压70 eV，接口温度为250 ℃，四极杆温度150 ℃；质量扫描范围50～550 m/z。

定性、定量分析：通过美国国家标准技术研究所（NIST）各挥发性风味物质的保留时间对大曲中挥发性香气物质进行定性分析，并通过面积归一法进行定量分析[18]。

（3）麸曲的制备及香气成分分析

麸曲的制备：取100 g细麸皮与70 mL水混匀，在121 ℃条件下灭菌15 min，加入孢子悬浮液5 mL，在30 ℃条件下培养3 d，每隔12 h扣瓶一次，保证其麸皮松散，菌株生长均匀。

麸曲中香气成分采用HS-SPME-GC-MS法。其色谱、质谱条件及定性定量方法同清香大曲中香气成分测定。

定性、定量分析：通过美国国家标准技术研究所（NIST）各挥发性风味物质的保留时间对大曲中挥发性香气物质进行定性分析，并通过面积归一法进行定量分析。

（4）麸曲中BCP含量分析

麸曲中BCP含量检测采用GC法[19]。样品预处理条件：取2 g麸曲，加入10 mL无水乙醇提取2 h，于8 000 r/min离心5 min，取上清液2.50 mL于5 mL容量瓶中，加入100 μL内标（质量浓度为167.40 mg/L的十二烷），定容至5 mL，过0.22 μm有机滤膜。GC条件：参照胡雪等[20]的方法。定性定量方法：采用保留时间定性，内标法定量[21-22]。

企业战略目标对绩效考核具有指导性，绩效考核体系的设计应与企业的战略规划保持一致，只有这样才能引导个人和团队树立共同的目标、激发工作热情、为组织发展和目标的实现努力。

1.3.2 清香大曲中产BCP菌株的初筛

将清香型大曲粉碎至20目后过筛，称取10 g曲样加入90 mL 0.90%的生理盐水中，于30 ℃、120 r/min摇床振荡30 min，用纱布过滤，并用0.90%生理盐水逐级稀释至适当稀释梯度，分别吸取稀释梯度为10-3倍、10-4倍、10-5倍、10-6倍的稀释液150 μL涂布于沙氏培养基，于30 ℃培养箱培养48 h，挑取生长较好的、菌落形态或镜检形态不同的单菌落，接种于PDA培养基培养，多次划线分离，直至得到纯种菌落，初步判定菌株类型参照《真菌鉴定手册》[23]。

1.3.3 清香大曲中产BCP菌株的复筛

孢子悬液的制备：取斜面保存的纯种菌株，加入5 mL灭菌后的0.90%生理盐水（加入体积占比为0.1%的吐温20），将其孢子冲入已灭菌且装有玻璃珠的空三角瓶中，在30 ℃条件下120 r/min振荡30 min，采用四层纱布过滤，利用血球计数板计数，将孢子悬浮液稀释至106～107个/mL。

取100 g细麸皮与70 mL水混匀，在121 ℃条件下灭菌15 min，加入106～107个/mL初筛选菌株孢子悬浮液5 mL，在30 ℃条件下培养3 d，每隔12 h扣瓶一次，保证其麸皮松散，菌株生长均匀，得到麸曲。测定麸曲中挥发性风味物质，复筛BCP产量高的菌株。

1.3.4 分子生物学鉴定

对产BCP的霉菌进行分子生物学鉴定，将样品送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序。引物设计为通用引物：ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），PCR扩增体系采用PCR Mix 21 μL、引物各1 μL、DNA模板2 ng/μL。PCR扩增程序为96 ℃预热5 min；96 ℃变性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 min，进行35个循环；然后于72 ℃终延伸10 min。反应结束后，取PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，观察条带性状，最后进行纯化测序。将最终的测序结果在美国国家生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank数据库中进行基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比对，并对近似序列进行系统发育学分析[24]。

1.3.5 麸曲中BCP提取条件优化

提取溶剂：取麸曲样品2 g、分别加入体积分数为60%乙醇、无水乙醇、石油醚（沸程为30～60 ℃）10 mL，静置提取1 h，考察提取溶剂对BCP含量的影响。

提取时间：取麸曲样品2 g、加入上述优化提取溶剂提取1 h、2 h、3 h，考察提取时间对BCP含量的影响。

1.3.6 产BCP菌株强化麸曲小坛发酵应用

取4 kg粉碎为4瓣的高粱，加入60%的60～70 ℃水拌匀，堆积润粮20 h后拌入20%清蒸稻壳，于121 ℃条件下灭菌30 min后进行分坛拌曲，每坛装500 g，空白组拌入10%清香型大曲，实验组拌入10%清香型大曲与5%强化麸曲，水密封发酵27 d后上甑蒸酒（保证中间高，两边低，缓慢蒸酒），蒸馏时按照“掐头去尾，量质摘酒”的原则接酒，取每甑蒸馏出的中段基酒等量混合为混合酒样[25]，根据GB 5009.225—2023《食品安全国家标准酒和食用酒精中乙醇浓度的测定》的酒精计法测定原酒酒精度，计算出酒率[26]。

1.3.7 数据分析

利用Excel 2019、SPSS 26.0处理数据，GC色谱图在软件Origin 2021中绘制，柱状图使用软件GrapHPad Prism 9绘制、系统发育树用MEGA-X软件绘制而成、热图使用软件Chiplot与Hiplot绘制。

2 结果与分析

2.1 清香型白酒中挥发性香气成分检测

为探究该清香型白酒中是否含有BCP，通过HS-SPMEGC-MS法对原酒中香气成分进行定性定量分析，具体见表1。

表1 清香型白酒挥发性风味物质的检测结果Table 1 Detection results of volatile flavor substances in light-flavor Baijiu

由表1可知，从该清香型白酒中检测出65种挥发性香气物质，包括酯类物质27种、酸类物质6种、醇类物质15种、醛酮类物质9种，吡嗪类物质2种、呋喃类物质2种、酚类物质2种、其他类物质2种。其中乳酸乙酯质量浓度为2.31 g/L，乙酸乙酯质量浓度为2.83 g/L，基本符合清香型白酒的风格，各类呈香物质丰富使清香型白酒酒体风味富有层次感，在清甜爽口中增添了陈酿的浓厚感。该清香型白酒中BCP含量为0.02 g/L，BCP是白酒中重要的萜烯类物质，在清香型白酒酒体中，萜烯类化合物不但具有缓解酒精伤害、预防疾病、促进康复、以及调节生理节奏的功效，还具有呈香或呈味的作用，但由于目前对白酒中BCP鲜有报道，需对其产生途径追根溯源，对白酒酿造过程中不可或缺的启动物质“大曲”进行深入研究和开发，对于提高白酒的风味和口感至关重要。

2.2 清香大曲中挥发性香气成分检测

大曲作为传统发酵食品原料，富含各类微生物，在制曲和酿造的过程中，微生物的不断生长和繁殖会产生大量的代谢物，这些代谢物是大曲酒独特风格和特色的主要来源[27]。对清香型白酒大曲的挥发性香气成分进行检测，结果见图1。由图1可知，清香大曲共检测出挥发性风味物质50种，其中酯类6种，醇类16种，酸类4种，酚类2种，醛酮类6种，吡嗪类10种，萜烯类1种，其他类5种，其相对含量分别为22.91%、14.25%、7.24%、1.11%、3.34%、39.25%、0.85%、3.13%。萜烯类物质BCP相对含量达到0.85%。结果表明，清香大曲中有可以产生BCP的菌株，于是需对清香大曲中产BCP的菌株进行分离筛选。

图1 清香大曲中挥发性风味物质相对含量检测结果Fig. 1 Detection results of relative contents of volatile flavor substances in light-flavor Daqu

2.3 清香大曲中菌株的分离筛选

通过稀释涂布平板法筛选该清香型大曲中生长状况良好，获得菌落或镜检形态不同的5株菌，编号为SDA1～SDA5，其菌落及细胞形态图见图2。

图2 清香大曲中筛选菌株的菌落（a）与细胞形态（b）Fig. 2 Colony (a) and cell (b) morphology of strains screened from light-flavor Daqu

由图2可知，5株菌株均菌落大、干燥疏松有菌丝。菌株SDA1、SDA4的菌落呈黑色，菌落较稀疏，无假根，初步鉴定为根霉属（Rhizopus）；菌株SDA2、SDA5的孢子呈白色，菌落较发达，菌落为白色，孢子束老熟后几乎透明无色，无假根，初步鉴定为毛霉属（Mucor）；菌株SDA3菌落质地棉絮状，基部菌丝白色，后变为灰褐色，假根不发达，孢子囊近球形，孢囊孢子近球形，初步鉴定为根霉属（Rhizopus）。

2.4 麸曲中挥发性香气成分检测

将筛选出的5株霉菌对麸皮进行发酵，利用HS-SPMEGC-MS法对其发酵产物进行挥发性香气成分检测，结果见图3。

图3 5株霉菌发酵麸曲中挥发性风味物质分析结果Fig. 3 Analysis results of volatile flavor substances of Fuqu fermented by 5 molds

由图3可知，5株菌株SDA1、SDA2、SDA3、SDA4及SDA 5对麸曲进行发酵后分别检测出挥发性香气物质17种、10种、23种、15种、18种。其中菌株SDA3麸曲中酯类物质的种类与相对含量明显高于其他菌株且在该麸曲中检测出了BCP的存在，其相对含量为1.04%。可以确定菌株SDA3在生长代谢过程中可产BCP，可能菌株SDA3含有合成BCP的酶，通过甲羟戊酸的上下游途径可得到BCP[6]。

2.5 筛选菌株的分子生物学鉴定

基于18S rRNA基因菌株SDA3的系统发育树见图4。由图4可知，菌株SDA3与数据库已有菌株戴尔根霉（Rhizopus delemar）同源性达100%，属同一分支，结合形态特征，确定产BCP的菌株SDA3为戴尔根霉（Rhizopus delemar），属于菌物界接合菌门接合菌纲毛霉目毛霉科戴尔根霉属生物。

图4 基于18S rRNA基因菌株SDA3的系统发育树Fig. 4 Phylogenetic tree of strain SDA3 based on 18S rRNA

2.6 麸曲中BCP提取条件优化

不同提取溶剂及提取时间对BCP含量的影响结果见图5。由图5a可知，BCP能更好的溶于无水乙醇，质量浓度达到37.98 mg/L，与其他提取物提取的BCP含量具有显著差异（P＜0.05），该结果可能与BCP不溶于水，但能溶解于乙醇等有机溶剂的溶解性有关。因此，最适提取溶剂为无水乙醇。由图5b可知，提取时间为3 h时，BCP的含量达到最高为38.23 mg/L。当提取时间为2 h、3 h时提取的BCP含量之间没有显著差异（P＞0.05）。当提取时间为2 h时，BCP质量浓度达37.98 mg/L。因此，为节约时间成本，最适提取时间为2 h。综合考虑，通过GC法检测BCP的含量，以十二烷作为内标，使用无水乙醇浸提样品2 h。

图5 不同提取溶剂（a）及提取时间（b）对β-石竹烯含量的影响Fig. 5 Effects of different extraction solvents (a) and extraction time(b) on β-caryophyllene content

2.7 产BCP菌株强化麸曲小坛发酵应用

将小坛发酵产物进行蒸馏，计算其出酒率，结果表明，与只添加了清香型大曲的对照组（CK）出酒率（8.17%）相比，加入清香型大曲和菌株SDA3强化麸曲的实验组出酒率为13.08%，实验组出酒率明显高于对照组，可能与霉菌可以分泌糖化酶、液化酶、蛋白酶等高活性酶有关，可以将原料中的淀粉分解生成糊精、麦芽糖，最终转化为葡萄糖，因此直接影响着原料的利用及其他种类微生物的生长代谢，进而提高出酒率。通过HS-SPME-GC-MS法对小坛发酵产物蒸馏的白酒香气成分进行分析，结果见表2。

表2 小坛发酵产物中挥发性风味物质检测结果Table 2 Determination results of volatile flavor substances in small tank fermentation products

由表2可知，实验组共检测出43种香气物质，其中，酯类物质20种、醇类9种、醛酮类3种、酚类1种、酸类2种、其他类8种，与对照组相比，香气成分种类增加了7种，分别为反式-4-癸烯酸乙酯、亚麻酸乙酯、苯甲醇、正己醇、4-羟基-2-丁酮、3,4-二甲氧基苯乙烯和羟甲基环丙烷，高级酯相对含量增长明显，主要是月桂酸乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯等，另外BCP的相对含量占比也更高。于是对清香型白酒的特征香气成分和相对含量较高的物质进行定量分析，结果见图6。

图6 小坛发酵酒体中主体特征挥发性风味物质含量检测结果Fig. 6 Determination results of major characteristic volatile flavor substances contents in Baijiu by small tank fermentation

由图6可知，加入菌株SDA3强化大曲酿造的白酒中乳酸乙酯、正丁醇、β-石竹烯增加明显，分别增加了167.83 mg/L、30.31 mg/L、11.00 mg/L，其中BCP含量从13.65 mg/L增加到了24.65 mg/L，该结果表明在酒的发酵过程中加入强化大曲可以增加酒体的香气成分，从而提高了白酒的品质。

3 结论

本研究中清香型白酒中BCP的质量浓度约为0.02 g/L，大曲中的BCP相对含量为0.85%，从大曲中筛选出在发酵过程中可产生BCP的菌株编号为菌株SDA3，其麸曲中BCP相对含量为1.04%，其被鉴定为戴尔根霉（Rhizopus delemar），麸曲中BCP最佳提取条件如下：提取溶剂为无水乙醇、提取时间为2 h，采用GC内标法进行定量分析，内标物为十二烷。在此优化条件下，BCP质量浓度可达到37.98 mg/L，经过小坛发酵应用，BCP含量可从13.65 mg/L增加至24.65 mg/L。

本研究可为白酒风味成分BCP的产生途径提供理论依据，后续可应用于白酒扩大生产过程中，以增强白酒香气及其品质。另外在增强稀有植物天然化合物的产量上也可以提供一定贡献，利用微生物有针对性地合成天然植物化合物，Rhizopus delemar可以通过微生物发酵提供一条BCP定向合成和规模化生产的新路径，可以显著增强稀有植物天然化合物的产量。