毛蕊异黄酮治疗脊髓损伤大鼠的作用机制

★ 陈静 熊润萍 帅品花 黄丽君 邓文静（江西中医药大学附属医院 南昌 330006）

随着交通工具及工业的不断发展，脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）的发生率逐年升高［1］，是导致神经功能障碍和残疾的主要疾病之一。目前临床上治疗SCI 主要依靠药物和外科手术［2］，虽在一定程度上缓解病情，但解决不了病患的根本问题，因此脊髓损伤仍是学者们研究的热点问题。近年来随着医学的发展，对脊髓损伤的病理机制研究不断加深，并且在脊髓损伤的防治过程中更加重视中医药治疗SCI 的机制探究［3］。补阳还五汤是治疗中枢神经损伤疾病的代表方，其中黄芪为君药，具有补益元气、促血行、祛瘀通络的作用［4］。毛蕊异黄酮是黄芪的黄酮类主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗病毒等作用，研究发现其对脊髓损伤具有潜在治疗作用［5］。但毛蕊异黄酮治疗脊髓损伤的详细作用机理尚未明确，值得进一步深入研究。相关研究发现，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）通路与脊髓修复机制紧密相关［6］。本研究通过改良Allen 重物打击法建立大鼠脊髓损伤模型，观察脊髓组织中病理情况和p-Akt、gp130、IL-6 蛋白表达，探讨毛蕊异黄酮治疗脊髓损伤的潜在作用机制。

1 材料

1.1 动物

30只8～10周龄大鼠（SPF级，雌性，200～250 g），购自江西中医药大学实验动物科技中心，生产许可证SCXK（赣）2018-0003。大鼠饲养于洁净环境中，温度（23±2）℃，湿度40%～70%，自由饮食摄水，12 h光暗交替，所有动物适应性喂养7 d后开始试验。

1.2 仪器与试剂

毛蕊异黄酮（成都普菲德生物技术有限公司，含量≥98%，批号JOT-10389）；山羊抗兔GAPHD多克隆抗体、gp130 抗体、IL-6 抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；免疫组化试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；DAB 显色试剂盒（北京中山生物技术有限公司）；荧光显微镜、倒置显微镜（日本OLYMPUS 公司）。

2 方法

2.1 脊髓损伤模型的建立

采用改良Allen 重物打击法制备脊髓损伤模型。造模组20 只大鼠均腹腔注射60 mg/kg 氯胺酮麻醉，俯卧位固定大鼠，在背部以T10 为中心，纵向切一3 cm 的小口，充分暴露T10 段脊髓。在T10 脊髓的表面放置一个直径为3 mm 的圆形薄片，用10 g 的砝码自由坠落12.5 cm 打击该垫片，造成T10 段脊髓的冲击伤，逐层缝合大鼠皮肤。当撞击脊髓时大鼠出现身体抖动，打击局部脊髓表面迅速呈瘀紫色，术后双下肢出现完全瘫痪时视为脊髓损伤模型制备成功。假手术组10 只大鼠只暴露T10段脊髓并不打击脊髓，其他步骤和造模大鼠相同。

2.2 分组、给药和术后护理

将30只大鼠分为假手术组10只和造模组20只，造模成功后随机分为模型组、毛蕊异黄酮组，各10 只。参考文献［7］，毛蕊异黄酮组每天给予毛蕊异黄酮20 mg/kg，假手术组、模型组每天以等量生理盐水灌胃，每天2 次；连续干预5 周。造模结束后，将所有大鼠置于25 ℃的动物房内统一饲养，将垫有锯末的平板置于大鼠笼中，以吸收排尿及防止肢体或骶部压疮，并及时更换。手术结束后人工排尿，2 次/d，各大鼠均连续排尿2 周，直至大鼠恢复自主排尿时停止。

2.3 行为学观察

采用双盲双人独立观察记录，在术后5 周进行行为学评分，采用改良Tarlov 评分［8］和斜板试验。改良Tarlov 评分标准：没有自主性的运动，只限于非反射性的髋、膝关节运动，0 和1 分；髋、膝、踝3 个关节的肢体运动，2 分；行走时可主动支撑体重和不协调步态或偶尔出现协调步态，3 分；活动时呈现前后肢协调步态，行动时有趾间关节的肢体运动，4 分；正常步态，5 分。斜板试验：取一块长方形木板，将2 mm 的橡胶垫垫于木板上，将大鼠头向前，身体纵轴与斜面板纵轴垂直放置，将木板与水平面之间的角度逐渐增大，直至大鼠在原定位置上刚好可以维持 5 s，将这一个角度称为倾斜平面临界角度。

2.4 皮层体感诱发电位检测

大鼠麻醉固定后，在腓肠肌中部置入刺激电极，用1.5～4 mA 刺激强度和1.9 Hz 刺激频率刺激大鼠。在头顶部中线与冠状缝交处头皮下置入记录电极，在其后方0.5 cm 处置入参考电极，将动物尾部用0.9%氯化钠浸湿并连接地线。于术后5 周用肌电图诱发电位仪检测大鼠的感觉诱发电位（SEP），观察皮层体感诱发电位波潜伏期变化。

2.5 HE 染色观察脊髓损伤的情况

造模干预5 周后麻醉大鼠并开胸，大鼠心脏用4%多聚甲醛灌注固定，将损伤区的脊髓组织切取2～3 mm，制成3 μm 的切片。样本切片经过HE 染色后置于显微镜下观察脊髓损伤的情况。

2.6 Western blot 检测各组大鼠脊髓损伤组织中p-Akt、gp130、IL-6 蛋白表达

处死各组大鼠，取20 mg 脊髓组织，在冰上研磨组织呈粉末状，将裂解液加入到组织中，制成组织悬液后离心，对蛋白样本总浓度进行测定。转移蛋白样品至PVDF 膜，倒入5%脱脂奶粉，封闭样品2 h。蛋白样品中分别加入一抗p-Akt、gp130、IL-6 和内参GAPHD 蛋白（1∶1000），孵育后洗涤蛋白样品，将二抗（1∶2000）加入到蛋白样品中，室温孵育1 h，用ECL 液显色。用Image J 软件观察条带灰度值并计算蛋白表达。

2.7 统计学方法

数据用SPSS 20.0 软件进行统计学分析。计量资料采用（±s）表示，采用独立样本t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 毛蕊异黄酮对SCI 大鼠行为学及皮层体感诱发电位波潜伏期的影响

5 周后，与假手术组比较，模型组中改良Tarlov评分及斜板试验倾斜角度显著降低（P＜0.05），皮层体感诱发电位波潜伏期均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，毛蕊异黄酮干预后改良Tarlov 评分及斜板试验倾斜角度显著上升（P＜0.05），皮层体感诱发电位波潜伏期均显著降低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠改良Tarlov评分、斜板实验、皮层体感诱发电位波潜伏时长比较（±s，n=10）

表1 各组大鼠改良Tarlov评分、斜板实验、皮层体感诱发电位波潜伏时长比较（±s，n=10）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

斜板实验倾斜角度/°组别 改良Tarlov评分/分皮层体感诱发电位波潜伏期时长/ms假手术组 4.77±0.38 64.38±3.21 17.23±1.12模型组 0.16±0.08* 21.04±0.25* 38.22±2.08*毛蕊异黄酮组 3.21±0.25# 33.82±5.22# 35.23±1.82#

3.2 毛蕊异黄酮对SCI 大鼠损伤组织结构的影响

在5 周时，假手术组见脊髓组织结构清晰，无明显细胞结构的破坏，灰、白质明显区分；模型组脊髓组织结构不清晰，少见完整的细胞结构，灰、白质较难区分；毛蕊异黄酮组脊髓组织结构较清晰，见少量细胞结构的破坏，灰、白质可区分。见图1。

图1 脊髓损伤HE染色观察（×100）

3.3 毛蕊异黄酮对SCI 大鼠损伤组织中p-Akt、gp130、IL-6 蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组中p-Akt、gp130、IL-6 蛋白水平显著上升（P＜0.05）；与模型组比较，毛蕊异黄酮干预后p-Akt、gp130、IL-6 蛋白水平显著降低（P＜0.05）。见表2、图2。

图2 Western blot法检测脊髓损伤组织中p-Akt、gp130、IL-6相对蛋白表达

表2 各组大鼠p-Akt、gp130、IL-6蛋白表达水平比较（±s，n=10）

表2 各组大鼠p-Akt、gp130、IL-6蛋白表达水平比较（±s，n=10）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 IL-6/GAPHD gp130/GAPHD p-Akt/GAPHD假手术组 2.01±0.08 1.63±0.04 0.50±0.03模型组 5.06±0.13* 2.11±0.08* 2.54±0.09*毛蕊异黄酮组 0.53±0.02# 0.73±0.01# 1.07±0.06#

4 讨论

目前脊髓损伤的治疗与干预措施是基础和临床研究的热点之一［9］，临床常以手术治疗脊髓损伤，但治疗效果并不十分理想，且治疗费用相对较高，导致患者及家庭难以接受。近年来随着中医学的发展，对脊髓损伤的病理机制研究不断加深，并且在脊髓损伤的防治过程中更加重视中医药治疗SCI 的机制探究［10-11］。

本实验结果显示，毛蕊异黄酮能促进脊髓损伤后大鼠后肢功能的恢复，降低了脊髓损伤后肢皮层体感诱发电位波潜伏期时长，证明毛蕊异黄酮有利于脊髓损伤后神经功能的恢复，与有关研究结果一致［12-13］。

涉及脊髓损伤修复的信号通路及引导因子有多种，PI3K/Akt 信号通路的激活已经被证实参与脊髓损伤的发生发展［14］。IL-6 作为炎症细胞分化的重要影响因子，在正常脑组织中表达较少，在神经疾病脑组织中高表达较高［15］。并且gp130 作为IL-6 等多种细胞因子的信号传导链，两者共同参与调节急性继发性SCI［5］。本研究结果表明，毛蕊异黄酮抑制了gp130、IL-6 蛋白表达及PI3K/Akt信号通路磷酸化。究其原因是，脊髓损伤后本身可以释放出一些能够将具有多种细胞因子的信号传导链，如gp130、IL-6 等受体，经过其磷酸化以后会特异性结合信号通路的调节亚基，从而将激活细胞信号通路。本研究发现毛蕊异黄酮抑制脊髓损伤组织gp130、IL-6 的表达，进一步说明毛蕊异黄酮可能通过PI3K/Akt 信号通路降低脊髓损伤区域炎症反应，从而改善脊髓功能。

综上所述，毛蕊异黄酮通过PI3K/Akt 信号通路恢复脊髓神经功能，为临床治疗脊髓损伤提供实验和理论依据。