铜绿假单胞菌Gxun-2 产铁载体发酵条件优化及其抑菌效果

2024-05-12李枢妍何艳丽宋超东黄夏至陆君铭李时勇张红岩申乃坤姜明国

食品工业科技 2024年10期

李枢妍，何艳丽，宋超东，黄夏至，陆君铭，李时勇，张红岩，申乃坤,*，姜明国

（1.广西民族大学海洋与生物技术学院，广西多糖材料与改性重点实验室，广西南宁 530008；2.西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨陵 712100）

铁元素因可参与生命体电子传递以及生理生化代谢反应等多种生命活动，成为大多数生物生长需要所必需的微量元素，虽然铁在地壳中含量较高，但在自然条件下易被氧化为溶解性极差的氧化铁或生成沉淀，转变为氢氧化铁，并不能直接被生物体吸收，导致作物出现缺铁现象[1]。铁载体（Siderophore）是微生物合成并分泌的一种对铁有高亲和性的低分子量化合物，对Fe3+具有超强的螯合作用，可以螯合环境中的铁离子以摄取铁元素[2]。而植物根际促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）可在缺铁条件下分泌铁载体，帮助微生物从环境中吸收Fe3+，增加环境中Fe3+移动，微生物分泌铁载体螯合环境中的Fe3+被认为是植物的有效铁来源的主要途径之一，从而促进植物生长[3-4]。此外，分泌铁载体的细菌通过与植物病原菌竞争铁离子，从而抑制病原菌生长[5-7]。如甘蔗和黑麦草根内的大肠杆菌分泌铁载体，从而促进了甘蔗和黑麦草的生长[8]；从泰国水稻根中分离出的内生链霉菌GMKU3100 产生的铁载体能促进水稻和绿豆生长，显著提高根茎生物量和长度[9]。在病原菌侵染植物过程中，植物细胞周围坚硬的细胞壁限制了病原菌在细胞内的繁殖，但病原菌可以分泌大量的细胞壁降解酶和效应蛋白，损伤植物细胞并从中获得营养物质，包括从寄主植物中获取铁元素以用于自身的生长繁殖。植物免疫系统严密调控着体内铁的稳态，限制病菌获取大量的铁元素，从而抑制病原菌的侵染。植物除了可以利用微生物分泌的铁载体满足自身生长发育外，还可以通过调节体内铁稳态，限制病原菌的铁吸收，抑制病原菌的侵染[10-13]。铁载体还在环境保护、微生物生态和医疗等方面都有着重要的影响[14-17]。因此，高产铁载体菌株的分离和条件优化具有重要的意义。

在微生物代谢过程中，培养基和发酵条件对菌体生长、产物合成及代谢物产量均有重要的影响，因此，对高产铁载体的菌株进行培养条件优化十分重要。吴岭等[18]对菌株WJ-3 进行产铁载体条件优化后，产生的铁载体螯合剂的合成率可达64.42%；伊凤娇[19]对解淀粉芽孢杆菌Y14 产铁载体能力优化后，铁载体活性单位达到62.09%，与最初的42.71%相比有明显的提高。杨常娥等[20]筛选得到的创伤弧菌V.vulnificusY8 经优化后的平均铁载体活性单位为89.68%，较优化前提高了23.73%。菌株Gxun-2为本实验室前期从香蕉根际土壤分离得到的一株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），可分泌铁载体，对香蕉枯萎病的病原菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporumf.sp.cubense，FOC4）具有良好的防病作用[21]，且对香蕉植株具有一定的促生效果。但目前对铜绿假单胞菌产铁载体条件优化研究还未见报道。

本研究先对P.aeruginosaGxun-2 产铁载体类型进行分析，进一步对该菌株产铁载体培养基及培养条件进行了优化，最后对优化前后铁载体发酵液对尖孢镰刀菌（FOC4）的抑制效果进行比较。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）Gxun-2 分离自健康香蕉根际土壤[12]，现保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61615；供试病原菌香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌（FOC4）分离自香蕉发病植株，鉴定并保藏于本实验室；葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、琼脂粉上海源叶生物科技有限公司；琥珀酸钠培养基（g/L）：琥珀酸钠4.0，K2HPO46.0，KH2PO43.0，（NH4）2SO41.0，MgSO4·7H2O 0.2，pH7.2；琥珀酸钠培养基+甘油（g/L）：琥珀酸钠4.0，K2HPO46.0，KH2PO43.0，（NH4）2SO41.0，MgSO4·7H2O 0.2，甘油15.0，pH7.2；MKB 培养基（g/L）：酸水解酪蛋白氨基酸5.0，K2HPO42.5，MgSO4·7H2O 1.5，甘油15.0，pH7.0；蔗糖-天冬氨酸（MSA）培养基（g/L）：蔗糖20.0，天冬氨酸2.0，K2HPO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，pH7.2。

Epoch 全自动酶标仪美国伯腾公司；BSP-150 生化培养箱上海博迅医疗生物仪器股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 产铁载体的检测参考Schwyn 等[22]的研究方法进行铁载体检测，将Gxun-2 菌株接种至CAS琼脂培养基中，28 ℃培养48 h，观察菌落周围颜色变化。采用Baakza 等[23]的方法对Gxun-2 产铁载体类型进行检测。

1.2.2 菌株Gxun-2 产铁载体发酵培养基单因素实验将Gxun-2 种子液以1%（v/v）的接种量分别接入到LB、MKB、蔗糖-天冬氨酸、琥珀酸钠以及琥珀酸钠+甘油的发酵培养基中，在温度35 ℃、转速200 r/min 以及装液量100/250 mL、自然pH 条件下培养3 d，测定不同发酵培养基产铁载体活性单位，筛选最优初始发酵培养基。在确定初始培养基的基础上，分别考察碳源种类（10.0 g/L 的甘油、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖和果糖）及碳源浓度（0、5、10、15、20、25 g/L）、琥珀酸钠浓度（0、2、4、6、8、10 g/L）、氮源种类（1 g/L 玉米浆、酵母粉、尿素、氯化铵和硫酸铵）及氮源浓度（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L）、无机盐种类（0.4 g/L的KCl、NaCl、CaCl2、海盐和ZnSO4）及无机盐浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L）对菌株Gxun-2 产铁载体Su 的影响。每组设3 个平行，结果取平均值。

1.2.3 菌株Gxun-2 产铁载体发酵条件单因素优化确定菌株Gxun-2 最优培养基组分后，以单因素实验分别考察发酵初始pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）、发酵时间（12、24、36、48、60、72、84 h）、发酵温度（25、30、33、35、37、40 ℃）、装液量（20、40、60、80、100、120、140、160、180 mL/250 mL）、接种量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，（v/v））对菌株产铁载体活性单位（Su）的影响。

1.2.4 Plackett-Burman（PB）试验及正交试验根据单因素实验的9 个因素，采用PB 设计对关键影响菌株Gxun-2 产铁载体Su 因素进行筛选，试验设计及结果见表1。选取PB 试验中影响较大的4 项因素，进行4 因素3 水平L9（34）的正交试验，试验设计见表2，从而确定产铁载体的最佳工艺。

表1 Plackett-Burman 试验设计Table 1 Design of Plackett-Burman experimental

表2 L9（34）正交试验因素水平设计Table 2 Design of L9(34) orthogonal

1.2.5 铁载体活性单位（Su）测定铬天青（chrome azurol sulfonate，CAS）检测液的配制：溶液A：准确称取CAS 0.079 g 溶于50 mL 去离子水中，再向其中加入1 mmol/L FeCl3溶液（HCl 配制）10 mL；溶液B：准确称取十六烷基三甲基溴化铵（HDTMA）0.069 g 溶于40 mL 的去离子水中；将溶液A 沿烧杯壁缓缓加入溶液B 中，搅拌混匀即得CAS 蓝色检测液[24]。

取发酵液2 mL，在12000 r/min，室温条件下离心2 min，保留上清液。将1 mL 上清液与1 mL CAS检测液混合，用去离子水稀释定容至15 mL，反应1 h 后在紫外可见分光光度计630 nm 处测量吸光度值（As），以无菌的培养基作为参比值（Ar），定量测定菌株的产铁量铁载体能力，即铁载体活性单位[25]。

式中：Su 表示铁载体活性单位；As 表示Gxun-2发酵上清液在紫外可见分光光度计630 nm 处的吸光度值；Ar 表示无菌培养基在紫外可见分光光度计630 nm 处的吸光度值。

1.2.6 菌株Gxun-2 对FOC4 的抑菌效果测定采用平板对峙法测定抑菌效果，以尖孢镰刀菌为靶标菌，28 ℃恒温培养5 d。观察菌株Gxun-2 铁载体发酵液对尖孢镰刀菌的抑制效果，计算抑菌率[26]。

式中：D 表示对照组靶标菌菌直径；d 表示试验组靶标菌菌落直径。

1.3 数据处理

每个试验设计3 个平行，结果取平均值。本研究使用IBM SPSS Statistics 21.0 对试验数据进行方差分析和显著性分析（P＜0.05），利用Design-Expert 10 软件对PB 试验数据进行分析，用GraphPad Prism 8 进行图形的绘制。

2 结果与分析

2.1 菌株Gxun-2 产铁载体的定性检测分析

菌株Gxun-2 在培养CAS 检测平板上培养2 d后，菌落周围有明显的橙黄色晕圈生成。证明菌株Gxun-2 能产生铁载体以螯合培养基中的铁（图1），进一步对产铁载体类型进行检测，在高氯酸铁试验中，由Gxun-2 制备的铁载体溶液颜色能够立即发生变化呈红色，并在495 nm 处出现吸收峰，这说明菌株Gxun-2 能分泌异羟肟酸型（hydroxamates）铁载体。

图1 菌株Gxun-2 CAS 平板检测结果Fig.1 CAS plate test result of strain Gxun-2

2.2 菌株Gxun-2 产铁载体培养基成分优化

由图2A 可知，以琥珀酸钠培养基＋甘油为基础培养基时，铁载体活性单位（Su）为44.40%±0.31%，显著高于其他几个培养基的Su（P＜0.05）。因此，选择琥珀酸钠培养基＋甘油为基础培养基进行下一步优化。碳源优化结果表明，菌株Gxun-2 分泌铁载体的最适碳源为甘油（图2B）；进一步对甘油浓度进行优化结果表明，当甘油添加量为5 g/L 和10 g/L 时，Su 分别达76.60%和77.05%，显著高于对照组（Su 7.52%）（P＜0.05），表明甘油在铁载体形成中具有重要的作用。但添加5 g/L 和10 g/L 甘油时，菌株的Su 无差异显著性（P＞0.05），因此，甘油的最适添加浓度为5 g/L（图2C）。这与Santos 等[27]报道巨大芽孢杆菌添加甘油会促进铁载体产生结果类似，其优化后铁载体产量达到1182 μmol/g（干重）。添加琥珀酸钠也可显著提高菌株Gxun-2 产铁载体能力，但当添加浓度为4 g/L（Su 73.80%）和6 g/L（Su 78.29%）时无显著性差异（P＞0.05），因此，琥珀酸钠的最佳添加浓度为4 g/L（图2D）。Rachid 等[28]的研究也表明P.fluorescensP5-18 的生长和产生铁载体的能力取决于培养基中铁的含量和碳源的类型，其在添加琥珀酸钠培养基中产生的铁载体量最高。氮源是合成细菌蛋白质、核酸等含氮物质和铁载体的来源。氮源优化结果表明菌株Gxun-2 既能利用有机氮源（玉米浆、酵母粉），也能利用无机氮源（氯化铵、硫酸铵、尿素），除玉米浆产铁载体较低外（Su 47.31%），其他几种氮源对铁载体影响并无差异显著性（P＞0.05），考虑生产成本，选择硫酸铵做为菌株Gxun-2 产铁载体最佳氮源（图2E）。进一步硫酸铵浓度优化结果为1.0 g/L，此时菌株Su 高达73.99%，是未加硫酸铵对照组的4.8 倍（图2F）。无机盐同样对菌株Gxun-2 产铁载体的能力有影响，海盐和硫酸镁的铁载体含量明显大于其他无机盐，且二者之间无显著性差异，考虑生产成本，选择海盐作为菌株Gxun-2 发酵培养基的无机盐，最适添加量为0.4 g/L，Su 最高可达76.30%（图2G～图2H）。

图2 培养基成分对菌株Gxun-2 产铁载体的影响Fig.2 Effects of media composition on strain siderophore of strain Gxun-2

2.3 菌株Gxun-2 产铁载体发酵条件优化

当发酵初始pH 在6.5～8.5，Su 并无显著差异（P＞0.05），但当初始pH＜6.0 时，菌株产铁载体能力显著降低，可能是由于过低的pH 影响了菌体生长和代谢。因此将菌株发酵的初始pH 控制在6.5～8.5（图3A）。发酵时间对菌株产铁载体的影响如图3B 所示，随着发酵时间延长，Su 逐渐增加，72 h时达到最高值（Su 77.13%），进一步延长发酵时间，Su 反而下降。因此，菌株产铁载体的最适发酵时间为72 h。发酵温度对菌株Su 影响较大，当发酵温度低于35 ℃时，Su 随发酵温度升高而增加；但当温度高于35 ℃时，Su 显著降低（P＜0.05），因此确定35 ℃为菌株Gxun-2 产铁载体的最适发酵温度（Su 78.00%±0.28%）（图3C）。由图3D 可知，当装液量为140/250 mL 时，Su 最高为77.14%，装液量120 mL/250 mL 次之，Su 为75.81%±0.33%，但两者无显著性差异（P＞0.05），综合考虑确定装液量为140 mL/250 mL。接种量在0.5%～3.0%（v/v）时，对菌株的Su 并无显著性影响，因此选择1%（v/v）为该菌株最佳产铁载体接种量（图3E）。

图3 发酵条件对菌株产铁载体的影响Fig.3 Effects of fermentation conditions on siderophore production in strains

2.4 Packett-Burman 试验分析

利用Design-Expert 10 软件对PB 试验数据进行分析，结果见表3。各影响因子显著性排序为：G＞C＞B＞A＞E＞H＞F＞J＞D。其中G、C、B、A、E、H具有显著性（表4），表明这6 个因素即发酵初始pH、硫酸铵浓度、琥珀酸钠浓度、甘油浓度、发酵时间和接种量是影响菌株产铁载体的重要因素，选择影响较大的4 个因素，即发酵初始pH、甘油、琥珀酸钠及硫酸铵浓度进行下一步正交试验。

表3 Plackett-Burman 试验设计和结果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experimental

表4 Plackett-Burman 试验各因素显著性分析Table 4 Significance analysis of each factor in Plackett-Burman

2.5 正交试验分析

4 因素3 水平正交试验结果（表5）表明，各因素对菌株产铁载体的影响的顺序为：硫酸铵浓度＞初始pH＞琥珀酸钠浓度＞甘油，且各影响因子最佳组合为：A2B1C2D1，即甘油10 g/L，琥珀酸钠2 g/L，硫酸铵1 g/L，初始pH 为6.8。但最优结果并未出现在正交表中，需要进行验证试验。菌株验证试验Su 结果为81.20%±0.24%，与预测值一致，表明正交试验的准确性。优化后Su 较优化前（44.40%±0.31%）提高了82.84%±0.82%。

表5 正交试验结果Table 5 Results of orthogonal experiment

近年来，对微生物产铁载体的条件优化的相关研究有很多，但因菌种不同，其生长情况和产铁载体类型不同，铁载体检测方法和优化结果也不同。陈伟等[29]在黑麦草根际土壤中筛选出一株铁载体产生菌WN-H3，在最佳发酵工艺（蔗糖10 g/L，酵母浸出粉5 g/L，NaCl 5 g/L，初始pH7.5，温度28 ℃，转速180 r/min，发酵48 h）条件下，该菌株铁载体Su 值可达80.4%。彭雯杰等[30]对分离出的阿斯青霉菌XK-12 工艺进行了优化，获得最佳发酵工艺为：添加NH4Cl 3 g/L、葡萄糖20 g/L、L-鸟氨酸 1g/L、初始pH6.0、发酵温度28℃、发酵周期168 h，该菌株铁载体最高可达0.173 mg/mL。与上述研究相比，菌株Gxun-2 产铁载体的pH 范围更广，在pH6.5～8.5 条件下均能产生大量铁载体，且该菌对温度的适应性更强，在30～37 ℃温度下仍然能产生大量铁载体，更利于在大规模发酵生产中的应用；同时，经过优化后菌株的培养中使用价格相对低廉的琥珀酸钠和甘油为碳源，硫酸铵为氮源，海盐为无机盐，在提高菌株产铁载体能力的同时，大大降低铁载体发酵的成本，为该菌株在农业的应用打下良好的基础。

2.6 菌株Gxun-2 产铁载体发酵液对FOC4 的抑菌效果

平板对峙实验研究结果表明，菌株Gxun-2 产铁载体发酵工艺优化前后对FOC4 的抑菌效果差别较大，优化后发酵液对FOC4 的抑制效果显著增加，抑菌率达70.60%±1.87%，较优化前提高了52.68%±4.23%（图4），这表明Gxun-2 及其优秀的产铁载体的能力在植物防病方面有巨大的应用。这与前人从土壤中分离出的铜绿假单胞菌NJ-5 和RZS3 功能一致，通过减少根际微生物区系中可用的铁离子数量来抑制病原菌的生长[31-33]。由此可见，铁载体可以用于植物病原菌的防治，铜绿假单胞菌Gxun-2 在抗病促生长方面有着较大的应用潜力。今后可对菌株产生的铁载体进行分离、纯化及结构鉴定，从而进一步对解析铁载体抑制病原菌的机理。

图4 菌株Gxun-2 产铁载体能力的增加对FOC4 的抑菌效果Fig.4 Inhibitory effects of Gxun-2 on FOC4 by increasing the siderophores-producing capacity

3 结论

本研究通过CAS 平板和全波段紫外光吸收法确定P.aeruginosaGxun-2 是一株高产异羟肟酸型铁载体的菌株。获得该菌株产铁载体最佳发酵工艺为：琥珀酸钠2 g/L、甘油10 g/L、硫酸铵1 g/L，初始pH6.8，温度35 ℃、接种量1%（v/v）、装液量140/250 mL。在此条件下，铁载体活性单位（Su）可达81.20%±0.24%，较优化前提高了82.84%±0.54%。优化后菌株Gxun-2 对香蕉枯萎病病原菌FOC4 的抑菌率达70.60%±1.87%，较优化前提高了52.68%±4.23%。总之，Gxun-2 具有良好产铁载体和抑制植物病原菌的作用，经发酵工艺优化，显著提高了菌株的铁载体含量和抑菌能力，为今后该菌株在农业中的应用打下良好的基础。