连翘饮片及其标准汤剂、挥发油包合物中挥发性成分分析*

高 晗,李 妍,田 方,李雪利

(1.神威药业集团有限公司,河北 石家庄 051430;2.云南神威施普瑞药业有限公司,云南 楚雄 675000;3.唐山学院外国语学院,河北 唐山 063000)

连翘为木樨科植物连翘的干燥果实,根据采收季节及炮制方式不同分为“青翘”和“老翘”[1],其味苦、性微寒,归肺、心、小肠经,具有清热解毒、消肿散结、疏散风热的功效。有研究结果显示,连翘具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、抗病毒、抗过敏、神经保护等作用[2-7]。目前,在连翘的提取物中共发现237种化合物,其中包括46种木脂素,31种苯乙醇糖苷,11种黄酮类化合物,80种萜类,20种环己醇衍生物,6种生物碱,4种类固醇和39种其他化合物[8]。其中,挥发性成分主要有α-松油烯、α-蒎烯、莰烯桧烯、β-蒎烯、α-水芹烯、α-松油烯、柠檬烯、β-水芹烯、γ-萜品烯、萜品油烯、β-月桂烯、β-罗勒烯、(+)-蒈烯、α-罗勒烯、芳樟醇、松油烯-4-醇、α-松油醇、反式香芹醇、樟脑[9-13]。

气相色谱-离子迁移谱法(GC-IMS)将GC和IMS技术进行结合,使得GC分析得到的化学信息更丰富,克服了IMS技术分离度差的问题。相较于GC-质谱联用技术等常用的挥发性成分检测方法,GC-IMS具有快速、灵敏、无需前处理的优势[14],已应用于农业、食品、药品测定等多个领域[15]。本研究依托GC-IMS技术对连翘饮片及其标准汤剂、挥发油包合物中挥发性成分进行差异分析,在明确挥发性成分种类的基础上,明确了在连翘药材提取、制备成标准汤剂过程中挥发性成分的传递情况。同时,本研究还分析了连翘挥发油包合物与标准汤剂中挥发性成分的组成,旨在为连翘配方颗粒生产、质量控制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1材料 FlavourSpec®型气相离子迁移谱联用仪(济南海能仪器股份有限公司),十万分之一CPA225D 电子分析天平(德国赛多利斯股份公司),高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司),养生药膳壶(合肥荣事达小家电有限公司),R502B旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司),2 L圆底烧瓶,MH-2000调温型电热套(北京科伟永兴仪器有限公司),β-环糊精(安徽山河药用辅料股份有限公司),95%乙醇(天津市科密欧化学试剂有限公司,分析纯)。水为纯化水,其余试剂均为分析纯。连翘药材(产地:陕西商洛;批号:2012231;挥发油含量:0.025%),经原河北省药品检验所鉴定为木樨科植物连翘Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl的干燥果实。

1.2方法

1.2.1样品前处理 (1)连翘饮片供试品制备:取连翘药材,除去杂质及异物,即得连翘饮片[16]。称取连翘饮片1.0 g(过四号筛),精密称定,置20 mL顶空瓶中。(2)连翘挥发油供试品制备:取连翘饮片20 g(批号:2012231),按2020年版《中国药典》2204挥发油测定法中甲法[17]进行挥发油提取。将冷凝后的挥发油由活塞口放出,加入无水硫酸钠适量,静置脱水20 min,精密量取连翘挥发油0.025 mL,置20 mL顶空瓶中。(3)连翘标准汤剂供试品制备:取连翘饮片100 g,加水煎煮2次,一煎加8倍水,浸泡30 min,煮沸,保持微沸煎煮20 min,120目筛网过滤,立即冷却至室温;二煎加6倍水,煮沸,保持微沸煎煮15 min,120目筛网过滤,立即冷却至室温;合并2次煎液,低温真空浓缩(浓缩温度小于或等于60 ℃)至生药比1∶3(g/mL),即得连翘标准汤剂[18-19]。分别精密量取连翘第1次提取液(4 mL)、第2次提取液(6 mL)、总提取液(14 mL)、标准汤剂(8 mL)、旋出液(旋转蒸发仪旋转蒸发出的液体,11 mL),置20 mL顶空瓶中。(4)连翘挥发油包合物供试品制备:按1 mL∶15 g(连翘挥发油∶β-环糊精)比例称取β-环糊精,加入6倍量水搅拌均匀。取连翘挥发油适量,按连翘挥发油与乙醇1∶1比例加入乙醇,搅拌均匀。向β-环糊精水溶液中缓慢滴入挥发油乙醇溶液,设定包合温度50 ℃,包合时间2 h,真空干燥。精密称定连翘挥发油包合物0.375 g,置20 mL顶空瓶中。

1.2.2测定条件 将上述供试品于75 ℃孵化20 min,顶空进样,使用GC-IMS进行测定。测定条件:FS-SE-54-CB-1色谱柱(0.53 mm×15 m,1 μm),载气/飘移气为氮气,气流量150 mL/min,探测器温度45 ℃,载气流量程序设定(0～2 min,2 mL/min;2～15 min,2 mL/min→10 mL/min;15～30 min,10 mL/min→150 mL/min;30～40 min,150 mL/min),柱温75 ℃,进样针温度85 ℃,进样量200 μL。

1.3统计学处理 使用仪器配套分析软件,包括实验室分析查看器(LAV)、GC-IMS Library Search。LAV可用于查看分析谱图,图中每1个点代表1种挥发性有机物,对其建立标准曲线后进行定量分析。其中,Reporter插件直接对比样品之间的谱图差异(二维俯视图和三维谱图);Gallery Plot插件可进行指纹图谱对比,直观且定量地比较不同样品之间挥发性有机物的差异。GC-IMS Library Search软件内置的NIST数据库和IMS数据库可对物质进行定性分析。

表1 连翘饮片挥发性成分汇总

2 结 果

2.1GC-IMS二维图谱分析 不同供试品中均含多种挥发油性成分,且挥发油含量存在明显差异。连翘饮片与连翘挥发油中挥发性成分基本一致;而连翘第1次提取液、第2次提取液、总提取液则明显与连翘饮片不同,在气相色谱保留时间600～800 s缺少相应的挥发油成分;提取液浓缩过程中挥发性成分仍然在损失,800～1 000 s挥发性成分转移至旋出液中。由连翘挥发油与连翘挥发油包合物比较可知,包合过程中,挥发性成分损失严重,部分挥发性成分未与β-环糊精形成包合而损失,仅部分挥发油形成稳定的包合物。但连翘挥发油包合物与连翘标准汤剂中挥发性成分基本保持一致。见图1。

图1 GC-IMS二维图谱

2.2GC-IMS指纹图谱分析 以GC-IMS二维图谱中的所有成分峰为分析对象,自动生成指纹图谱,见图2。连翘提取液中仍然含有大量挥发油,包括α-蒎烯、柠檬烯及1、2、4、5、9、10、11物质。连翘标准汤剂中主要含有的挥发油包括α-蒎烯、柠檬烯及1、2、4、5物质,且浓度和提取液中的基本一致,都是保留时间相对较小的物质。而旋出液中则主要含有9、10、11物质,且浓度和提取液中的基本一致,都是保留时间相对较大的物质。

注:每行代表1个样品中全部的挥发性成分峰,每列代表同一种类成分在不同供试品中的信号峰1～11未知成分。

连翘挥发油中的萜烯类物质浓度非常高,但做成连翘挥发油包合物后,挥发油浓度大幅降低,物质的种类则和连翘标准汤剂一致,浓度也相差不大,可以通过添加该包合物到连翘颗粒中来还原标准汤剂中的挥发油。

2.3连翘样品中挥发性成分定性分析 应用GC-IMS Library Search软件内置的NIST数据库和IMS数据库对连翘挥发性成分进行定性分析,结果见图3、表1。连翘挥发油含有14种成分,其中12种为未知成分,3种已知成分分别为α-蒎烯、柠檬烯、芳樟醇。

图3 连翘饮片挥发性成分定性分析

3 讨 论

FlavourSpec®型气相离子迁移谱联用仪在非真空且无样品前处理前提下,经顶空进样后可快速检测连翘饮片、标准汤剂、挥发油包合物中的挥发性成分,其根据挥发性物质GC保留时间和离子迁移时间进行定性分析。本研究共检测出14种挥发性化合物成分,并通过NIST2014气相保留指数数据库与IMS数据库比对,确定了3种挥发性物质。对连翘饮片、连翘标准汤剂、连翘挥发油包合物的挥发性成分进行关联性分析,可对连翘配方颗粒生产具有一定指导意义。

连翘中萜烯类挥发油在GC-IMS图谱中的出峰形状非常有特点,在同一保留指数下有很多不同迁移时间的样品峰,形成一条横向的条带,容易识别。从GC-IMS图谱中条带数目及亮度可以看出,连翘饮片的第1次提取液、第2次提取液及混合液中挥发油成分基本一致。连翘药材和挥发油中的萜烯类物质非常丰富,而提取液中主要含有α-蒎烯、柠檬烯及1、2、4、5、9、10、11物质。连翘标准汤剂中含有较低保留指数的挥发油,包括α-蒎烯、柠檬烯及1、2、4、5物质;而保留指数相对高的挥发油(9、10、11物质)则进入旋出液中。挥发油在包埋过程中大量损失,包合物中含有的萜烯类物质种类和连翘标准汤剂中的一致,且浓度相似,因此可以直接添加到连翘颗粒中用于还原标准汤剂中的挥发油。本研究通过对连翘饮片、连翘标准汤剂、连翘挥发油包合物的挥发性成分进行了关联分析,最大限度地还原了标准汤剂中挥发油类成分,为后续配方颗粒生产过程中挥发油的控制提供了保证。

综上所述,连翘挥发油包合物与连翘挥发油成分存在差异,但与连翘标准汤剂基本一致,可为连翘配方颗粒生产、质量控制提供参考。本研究丰富了连翘标准汤剂制备过程中挥发油类成分转移的研究,但仅鉴定出3种成分,可能为标准汤剂制备过程中挥发油类成分的组分发生一定变化所致,因此下一步将继续进行深入研究。